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1、6.2交聯(lián)β-葡聚糖含量測定AACC32-236.2.1實驗?zāi)康脑诖篼?、麥芽、麥芽汁和啤酒產(chǎn)品質(zhì)量控制中經(jīng)常需要測定其中的β-葡聚糖含量，Megazyme方法很好的解決了測定中的系列問題，本方法能夠在一天內(nèi)測定50-100個樣品。本方法現(xiàn)在也適用于燕麥產(chǎn)品及燕麥纖維產(chǎn)品β-葡聚糖含量測定。6.2.2實驗原理樣品水化后加入真菌多糖酶在pH6.5緩沖液中培養(yǎng)，提取液離心（或過濾）后加入β-葡萄糖苷酶，在葡糖糖氧化－過氧化酶緩沖液保護下產(chǎn)生葡萄糖。圖6.1葡聚糖測定原理示意圖Megazyme測試包：（可以測定100個樣品）⑴全套測定方法；⑵真菌多糖酶；⑶β
2、-葡萄糖苷酶；⑷葡糖糖標準液；⑸大麥和燕麥纖維標準樣品。6.2.3實驗試劑：⑴真菌淀粉酶（bottle1）〔（1-3）（1-4）β-D-葡萄糖4-葡聚糖水解酶〕：（活力>1000U/mL）制備：1.0mL真菌淀粉酶用20mMNaH2PO4緩沖液（pH6.5）稀釋至20.0mL。將溶液分裝成5.0mL在冰箱中冷凍保存。最終真菌淀粉酶濃度50U/mL。⑵β-葡萄糖苷酶（bottle2）：（活力>40U/mL）制備：將1.0mLβ-葡萄糖苷酶用50.0mM醋酸鈉緩沖液（pH4.0）稀釋至20.0mL。將溶液分裝成5.0mL在冰箱中冷凍保存。最終β-葡萄糖苷
3、酶濃度2U/mL。⑶葡糖糖標準液：100μg0.1mL，用0.2%疊氮化鈉溶液溶解。⑷大麥標準樣品：含量見標簽。⑸燕麥纖維標準樣品：含量見標簽。⑹NaH2PO4緩沖液制備（20mM，pH6.5）：3.12gNaH2PO4－2H2O溶解于900ml蒸餾水中，用100mM氫氧化鈉溶液（4g/L）將pH值調(diào)至6.5（大約需50mL），加0.2g疊氮化鈉，將溶液定容至1L。4℃保存。⑺醋酸鈉緩沖液（50mM，pH4.0）：飽和醋酸（2.9mL）加入900mL蒸餾水，用1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至4.0，加0.2g疊氮化鈉，將溶液定容至1L，4℃保存。⑻葡萄糖氧化
4、－過氧化酶緩沖液：建議使用Megazyme測試包里的高純度葡萄糖氧化溶液和葡糖糖過氧化酶。將測試包的葡萄糖工作液（bottle3）（50mL）稀釋至1L。把測試包中的葡萄糖測定液（bottle4）用1L葡萄糖工作液溶解（簡稱GOPOD）。為了保證GOPOD溶液的穩(wěn)定性，應(yīng)該在低溫條件下在棕色瓶中避光保持。測定過程中從冰箱中取出的涼的GOPOD溶液可以直接加入測定管。葡萄糖工作液包括：CaHPO4－2H2O（136.0g），NaOH（42.0g），酸（30.0g），疊氮化鈉（4.0g）。6.2.4儀器需求：⑴聚丙烯具塞試管（35mL）；⑵移液器：量程分
5、別為100μL，200μL，5.0mL（用于Na2HPO4緩沖液和葡萄糖氧化－過氧化酶緩沖液），25mL（用蒸餾水）。⑶頂載天平：1/1000g。⑷漩渦混合器；⑸分光光度計：510nm。⑹水浴鍋：40℃和100℃水浴鍋各一個。⑺秒表：一只。⑻離心機：離心力100g。⑼試驗粉碎機：細度0.5mm。6.2.5測定步驟：⑴將燕麥用試驗粉碎機粉碎成細度0.5mm的顆粒。⑵仔細稱量燕麥粉樣品（0.5g左右），放入35mL聚丙烯具塞試管。樣品需要已知水分含量，以便最后轉(zhuǎn)為干基。⑶向試管中加入1.0mL50%（v/v）的乙醇溶液，使樣品充分潤濕。⑷加入5.0mLN
6、aH2PO4緩沖液（20mM，pH6.5），在漩渦混合器上充分混合。⑸將試管放入100℃水浴鍋中保溫5min。每隔0.5min取出快速在漩渦混合器上混合。前2.0min加熱及混合效果對于結(jié)果影響較大。⑹將試管在室溫下降至40℃，向每個試管加入0.2mL真菌淀粉酶（10U）。試管加蓋，震蕩混勻，放入40℃水浴鍋中保溫1h。每隔10min將樣品在漩渦混合器上混合。⑺向每個試管加入24mL蒸餾水，將溶液體積調(diào)整為30mL。⑻將試管放入離心機中，在1000g離心力下離心10min。⑼用移液槍移取0.1mL樣品液，分別放入3個玻璃試管。一個玻璃試管作對照，另外
7、兩個為代測樣品。⑽按如圖6.1所示加入試劑。黑色方框為比色杯。一次可以同時完成11個樣品的測試。⑾將玻璃試管放入40℃水浴鍋中保溫15min。⑿向每支試管加入3.0mLGOPOD溶液，在40℃水浴鍋中保溫20min。葡萄糖標準液對照測試樣品醋酸鈉緩沖液葡萄糖標準液葡聚糖酶樣品液蒸餾水圖6.2葡聚糖測定試劑及樣品添加示意圖⒀將試管中液體轉(zhuǎn)入1.0cm比色杯，在510nm測定吸光度。1h內(nèi)完成測定。⒁計算β-葡聚糖含量：樣品干重＝樣品重量×（100-水分含量）/100β-葡聚糖含量（％w/w）＝吸光度×F×300×（1/1000）×（100/W）×（16
8、2/180）＝吸光度×（F/W）×27F＝100/葡糖糖標準溶液吸光度；300為體積校正系數(shù)；162/180
