β-葡聚糖測(cè)定方法.doc

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1、6.2交聯(lián)β-葡聚糖含量測(cè)定AACC32-236.2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑诖篼?、麥芽、麥芽汁和啤酒產(chǎn)品質(zhì)量控制中經(jīng)常需要測(cè)定其中的β-葡聚糖含量，Megazyme方法很好的解決了測(cè)定中的系列問(wèn)題，本方法能夠在一天內(nèi)測(cè)定50-100個(gè)樣品。本方法現(xiàn)在也適用于燕麥產(chǎn)品及燕麥纖維產(chǎn)品β-葡聚糖含量測(cè)定。6.2.2實(shí)驗(yàn)原理樣品水化后加入真菌多糖酶在pH6.5緩沖液中培養(yǎng)，提取液離心（或過(guò)濾）后加入β-葡萄糖苷酶，在葡糖糖氧化－過(guò)氧化酶緩沖液保護(hù)下產(chǎn)生葡萄糖。圖6.1葡聚糖測(cè)定原理示意圖Megazyme測(cè)試包：（可以測(cè)定100個(gè)樣品）⑴全套測(cè)定方法；⑵真菌多糖酶；⑶β

2、-葡萄糖苷酶；⑷葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)液；⑸大麥和燕麥纖維標(biāo)準(zhǔn)樣品。6.2.3實(shí)驗(yàn)試劑：⑴真菌淀粉酶（bottle1）〔（1-3）（1-4）β-D-葡萄糖4-葡聚糖水解酶〕：（活力>1000U/mL）制備：1.0mL真菌淀粉酶用20mMNaH2PO4緩沖液（pH6.5）稀釋至20.0mL。將溶液分裝成5.0mL在冰箱中冷凍保存。最終真菌淀粉酶濃度50U/mL。⑵β-葡萄糖苷酶（bottle2）：（活力>40U/mL）制備：將1.0mLβ-葡萄糖苷酶用50.0mM醋酸鈉緩沖液（pH4.0）稀釋至20.0mL。將溶液分裝成5.0mL在冰箱中冷凍保存。最終β-葡萄糖苷

3、酶濃度2U/mL。⑶葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)液：100μg0.1mL，用0.2%疊氮化鈉溶液溶解。⑷大麥標(biāo)準(zhǔn)樣品：含量見(jiàn)標(biāo)簽。⑸燕麥纖維標(biāo)準(zhǔn)樣品：含量見(jiàn)標(biāo)簽。⑹NaH2PO4緩沖液制備（20mM，pH6.5）：3.12gNaH2PO4－2H2O溶解于900ml蒸餾水中，用100mM氫氧化鈉溶液（4g/L）將pH值調(diào)至6.5（大約需50mL），加0.2g疊氮化鈉，將溶液定容至1L。4℃保存。⑺醋酸鈉緩沖液（50mM，pH4.0）：飽和醋酸（2.9mL）加入900mL蒸餾水，用1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至4.0，加0.2g疊氮化鈉，將溶液定容至1L，4℃保存。⑻葡萄糖氧化

4、－過(guò)氧化酶緩沖液：建議使用Megazyme測(cè)試包里的高純度葡萄糖氧化溶液和葡糖糖過(guò)氧化酶。將測(cè)試包的葡萄糖工作液（bottle3）（50mL）稀釋至1L。把測(cè)試包中的葡萄糖測(cè)定液（bottle4）用1L葡萄糖工作液溶解（簡(jiǎn)稱(chēng)GOPOD）。為了保證GOPOD溶液的穩(wěn)定性，應(yīng)該在低溫條件下在棕色瓶中避光保持。測(cè)定過(guò)程中從冰箱中取出的涼的GOPOD溶液可以直接加入測(cè)定管。葡萄糖工作液包括：CaHPO4－2H2O（136.0g），NaOH（42.0g），酸（30.0g），疊氮化鈉（4.0g）。6.2.4儀器需求：⑴聚丙烯具塞試管（35mL）；⑵移液器：量程分

5、別為100μL，200μL，5.0mL（用于Na2HPO4緩沖液和葡萄糖氧化－過(guò)氧化酶緩沖液），25mL（用蒸餾水）。⑶頂載天平：1/1000g。⑷漩渦混合器；⑸分光光度計(jì)：510nm。⑹水浴鍋：40℃和100℃水浴鍋各一個(gè)。⑺秒表：一只。⑻離心機(jī)：離心力100g。⑼試驗(yàn)粉碎機(jī)：細(xì)度0.5mm。6.2.5測(cè)定步驟：⑴將燕麥用試驗(yàn)粉碎機(jī)粉碎成細(xì)度0.5mm的顆粒。⑵仔細(xì)稱(chēng)量燕麥粉樣品（0.5g左右），放入35mL聚丙烯具塞試管。樣品需要已知水分含量，以便最后轉(zhuǎn)為干基。⑶向試管中加入1.0mL50%（v/v）的乙醇溶液，使樣品充分潤(rùn)濕。⑷加入5.0mLN

6、aH2PO4緩沖液（20mM，pH6.5），在漩渦混合器上充分混合。⑸將試管放入100℃水浴鍋中保溫5min。每隔0.5min取出快速在漩渦混合器上混合。前2.0min加熱及混合效果對(duì)于結(jié)果影響較大。⑹將試管在室溫下降至40℃，向每個(gè)試管加入0.2mL真菌淀粉酶（10U）。試管加蓋，震蕩混勻，放入40℃水浴鍋中保溫1h。每隔10min將樣品在漩渦混合器上混合。⑺向每個(gè)試管加入24mL蒸餾水，將溶液體積調(diào)整為30mL。⑻將試管放入離心機(jī)中，在1000g離心力下離心10min。⑼用移液槍移取0.1mL樣品液，分別放入3個(gè)玻璃試管。一個(gè)玻璃試管作對(duì)照，另外

7、兩個(gè)為代測(cè)樣品。⑽按如圖6.1所示加入試劑。黑色方框?yàn)楸壬?。一次可以同時(shí)完成11個(gè)樣品的測(cè)試。⑾將玻璃試管放入40℃水浴鍋中保溫15min。⑿向每支試管加入3.0mLGOPOD溶液，在40℃水浴鍋中保溫20min。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)照測(cè)試樣品醋酸鈉緩沖液葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液葡聚糖酶樣品液蒸餾水圖6.2葡聚糖測(cè)定試劑及樣品添加示意圖⒀將試管中液體轉(zhuǎn)入1.0cm比色杯，在510nm測(cè)定吸光度。1h內(nèi)完成測(cè)定。⒁計(jì)算β-葡聚糖含量：樣品干重＝樣品重量×（100-水分含量）/100β-葡聚糖含量（％w/w）＝吸光度×F×300×（1/1000）×（100/W）×（16

8、2/180）＝吸光度×（F/W）×27F＝100/葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度；300為體積校正系數(shù)；162/180