豬瘟疫苗毒與野外毒抗原性之差異豬瘟疫苗毒與野外毒抗...

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1、豬瘟疫苗毒與野外毒抗原性之差異潘居祥　鍾明華　黃金城　黃天祥　楊喜金　李淑慧　林士鈺行政院農業(yè)委員會家畜衛(wèi)生試驗所摘　　要本試驗係從病毒性狀及胺基酸序列差異上，探討豬瘟疫苗毒與野外毒兩者抗原性之差異。從一豬瘟病毒七種不同的限制酶圖譜中選取36株野外分離毒，採用新城病毒增強法(END)及E干涉一法測定病毒性狀。結果出現(xiàn)34株以END法呈陽性屬於強毒株，2株以E干涉法呈陽性屬於弱毒株。應用病毒斑點性狀測定法(IIPS)，依病毒斑灶大小可清楚區(qū)別LPC疫苗毒及ALD強毒株所產生之病毒斑灶，但不同野外毒病毒斑灶則出現(xiàn)大小不一的現(xiàn)象。

2、另將LPC疫苗毒及ALD強毒株病毒核酸中，與中和抗體產生有關的E0、E1及E2醣蛋白基因(2,235bp)進行核酸定序，並將核酸序列轉譯成胺基酸序列，共可轉換成745個胺基酸。比較兩者胺基酸總體相似性高達94.7﹪，但在胺基酸序列471及480之間大約在E2醣蛋白Bdomain位置出現(xiàn)高度變異，此區(qū)間10個胺基酸序列中即出現(xiàn)高達6個相異的胺基酸序列。一關鍵詞：豬瘟病毒關鍵詞：豬瘟病毒、新城病毒增強法：豬瘟病毒、新城病毒增強法、、新城病毒增強法、E干涉法、間接免疫酵素標幟染色法干涉法、間接免疫酵素標幟染色法、核酸、間接免疫酵素

3、標幟染色法、核酸定序緒　　言由於豬瘟病毒對各種品系和各階段年齡的豬隻都會感染，很難依毒性不同作毒株的分類，一般常依豬隻感染豬瘟後，臨床上呈現(xiàn)的各種嚴重程度及病程的長短，將豬瘟病毒的毒力區(qū)分成：強毒株、中間毒株和弱毒株。此三種病毒株與LPC疫苗毒之間抗原性差異有多大？現(xiàn)行LPC疫苗種毒已經使用30多年，LPC疫苗毒對於各種豬瘟野外毒變異株能否具有完全保護效力則缺乏文獻資料。因此有必要探討豬瘟疫苗毒與野外毒兩者間抗原性之差異，並評估目前使用之LPC疫苗毒對於不同豬瘟野外毒之免疫效力，以做為LPC疫苗改良及豬瘟防疫之依據。目前從病

4、毒的分子生物學上很難區(qū)別豬瘟病毒的毒性強弱，有學者以豬瘟病毒在試管內的培養(yǎng)特性來區(qū)別毒株的強弱。據VanOirschot[16]的說法，豬瘟強毒株的理想培養(yǎng)溫度是39~40C，弱毒株為33~34C，而中間毒株則介於強毒株和弱毒株之間為35~38C，強毒株的豬瘟病毒在PK-15細胞上的增殖速度較其它兩者來的快且力價高，以免疫螢光抗體染色法區(qū)別也發(fā)現(xiàn)強毒株的螢光較強且病灶較大[7]。此外，強毒株在56C溫度下的耐受性也較弱毒株和中間毒株強。Pirtle和35-5-1Mengeling[12]將分離自慢性豬瘟病例的病毒和抗強毒株的

5、免疫血清進行中和試驗，結果發(fā)現(xiàn)病毒對自家血清的中和反應效力較不同源血清的反應來得高，這表示強毒株與弱毒株之間的抗原性有所不同。所以VanOirschot[16]依血清中和試驗的結果將豬瘟病毒分類為兩種亞群(subgroup)，第一種亞群是包含了豬瘟強毒株和已馴化的疫苗毒株，而第二種亞群是豬瘟弱毒株和中間毒株，其中以第二種亞群毒性較弱的豬瘟病毒在血清學上和牛的BVD病毒的關係較相近。潘[1]應用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及限制酶片段多形性(RFLP)兩種技術已可將豬瘟野外毒區(qū)分為5種不同毒株。在病毒特性方面，豬瘟病毒以

6、組織培養(yǎng)細胞在試管(包括培養(yǎng)盤)中之毒性，可測得三一一種性狀，即以END法測出陽性者為強毒病毒，以E干涉法測出陽性者屬GPE型弱毒性病毒，一而以E二段法測出陽性病毒，係屬兔化豬瘟毒型病毒。顯示可利用此三種方法檢測野外分離毒[2]。豬瘟病毒基因具有一個開放讀碼區(qū)(Openreadingframe；ORF)[8]，其3'端不具poly-ATail，5'端和3'端各有一段非轉譯區(qū)5'-UTR與3'-UTR。豬瘟病毒基因在開放讀碼區(qū)轉譯出一段3,898個譯碼(codons)之多之(polypeptide)，此為病毒蛋白質前驅物(pr

7、ecursorprotein)，在經過病毒或宿主的酵素切割作用後才會形成成熟的病毒結構性蛋白[14][17]。豬瘟病毒結構性蛋白主要包含有nucleocapsidprotein(p14)及三種gp44/48(E0)、gp33(E1)、gp55(E2)之封套蛋白(envelopglycoprotein)[4]，其中以gp55(E2)研究最多也最早被定位，gp55含有豬瘟病毒主要抗原決定基(epitope)，亦為中和抗體產生之主要蛋白[9][19]，其文獻上記載病毒封套蛋白與抗原性最具有相關性。本試驗即藉由核酸定序及胺基酸轉譯之

8、方法，嘗試從病毒封套蛋白胺基酸之序列差異上瞭解豬瘟強毒株(ALD)與兔化豬瘟疫苗毒(LPC)兩者在抗原性上之差異。材料與方法一一、一、、病毒、病毒來源1.ALD豬瘟強毒株：本株病毒用豬隻繼代保存，以發(fā)病豬之脫纖血作為病毒來源。2.LPC兔化豬瘟疫苗株：本試驗使用者為經家兔繼代第824代之病