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《DB22T 1608-2012 牛病毒性腹瀉粘膜病病毒熒光RT-PCR檢測方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS65.020.30B41備案號：35742-2013DB22吉林省地方標準本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T1608—2012牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒熒光RT-PCR檢測方法本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofBovineviraldiarrhea/mucosaldisease2012-12-01發(fā)布2013-01-01實施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T1608—2012本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印前言
2、本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由吉林出入境檢驗檢疫局提出并歸口。本標準起草單位：吉林出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心。本標準主要起草人：孟慶峰、王偉利、吳連鵬、王瑋琳、肖成蕊、蔡陽、宋戰(zhàn)昀、孟日增。本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印I本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T1608—2012本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒熒光RT-PCR檢測方法1范圍本標準規(guī)定了牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒（bovineviraldiarrhea/mucosaldisease，BVDV）熒光RT-PCR檢測方法
3、。本標準適用于牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3縮略語下列縮略語適用于本文件。本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印Ct值：達到閾值的循環(huán)數(shù)（CycleThreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（Ribonucleic
4、Acid）熒光RT-PCR：熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）4原理采用TaqMan方法，比對牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒基因組5'端非編碼區(qū)最保守的核苷酸序列，設(shè)計特異性引物和特異性的熒光雙標記探針進行配對。探針5'端標記FAM熒光素為報告熒光基團（用R表示），3'端標記TAMRA熒光素為淬滅熒光基團（用Q表示），它在近距離內(nèi)能吸收5'端熒光基因發(fā)出的熒光信號。PCR反應進入退火階段時，引物和探針同時與目的
5、基因片段結(jié)合，此時探針上R基團發(fā)出的熒光信號被Q基因所吸收，儀器檢測不到熒光信號；而反應進行到延伸階段時，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能將探針降解。這樣探針上的R基團游離出來，所發(fā)出的熒光不再為Q所吸收而被檢測儀所接收。隨著PCR反應的循環(huán)進行，PCR產(chǎn)物與熒光信號的增長呈現(xiàn)對應關(guān)系。5試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水；所有試劑均用無RNA酶的容器分裝。5.1試劑1DB22/T1608—20125.1.1水：配制方法見附錄A.1。5.1.2Catrimox-14(Cat-14)。5.1.
6、3酚。本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印5.1.4三氯甲烷。5.1.5檸檬酸鈉。5.1.6正丁醇。5.1.7乙酸鈉。5.1.8乙醇。5.1.9異丙醇（-20℃預冷）。5.1.10其他試劑：AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/μL)、RnaseInhibitor(40U/μL)、10×AMVRTPCRbuffer、MgCL2(25mM)、dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)。5.1.11引物：根據(jù)病毒性腹瀉/粘膜病病毒（BVDV）國際標準株基因序列設(shè)計合成一對特異性引物：上游引物5'-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3'
7、，下游引物5'-AACCACTGACGACTACCCTGTACT-3'，TaqMan探針（FAM）5'-CCATCCAACGAACTCACCACTGTTGC-3'（TAMRA）均配制成20umol/L，-20℃保存。5.2對照樣品的制備5.2.1陽性對照樣品由指定單位提供或下列方法制備：將牛病毒性腹瀉粘膜病國際標準毒株按10%接種原代牛睪丸細胞，于37℃吸附1h后加入維持液（見附錄A.2），37℃培養(yǎng)，待CPE達到70%時收獲病毒懸液，凍融2次～3次，5000r/min離心10min，取上清液備用。5.2.2陰性對照樣品由指定單位提供或下列方
8、法制備：將生長良好的原代睪丸細胞，凍融2次-3次，本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印5000r/min離心10min，取上清液備用。6儀器6.1熒光PCR檢測儀。6.2高速
