brdu標記在大鼠睪丸支持細胞體外培養(yǎng)中的應用

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1、BrdU標記在大鼠睪丸支持細胞體外培養(yǎng)中的應用【摘要】目的:探討大鼠睪丸支持細胞原代培養(yǎng)5溴2脫氧尿苷（BrdU）的最佳標記時間、劑量。方法:大鼠睪丸支持細胞進行體外原代培養(yǎng);以終濃度分別為5、10、15、20μmol/L的BrdU檢測睪丸支持細胞的最佳標記劑量;在細胞培養(yǎng)的12、24、36、48h摻入BrdU,使終濃度為15μmol/L,測定BrdU的最佳標記時間;免疫細胞化學法跟蹤觀察大鼠睪丸支持細胞在體外培養(yǎng)中的分化發(fā)育情況和BrdU標記率。結(jié)果:免疫組化檢查提示最終濃度為15μmol/L和孵育36hBrdU標記率均>90%,并且

2、連續(xù)傳3代均可檢測到。結(jié)論:終濃度15μmol/L及孵育36h為BrdU標記睪丸支持細胞的最佳劑量及時間,表明BrdU標記可用于睪丸支持細胞體內(nèi)后的存活、生長的動態(tài)觀察?！娟P鍵詞】睪丸支持細胞體外培養(yǎng)BrdU5溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記法作為一種簡便、敏感、特異的檢測方法,在醫(yī)學的各個領域都有廣泛的應用。BrdU摻入合成的強度可直接顯示細胞增殖的能力,同時能避免以往應用3HTdR檢測對細胞的放射性損害[1]。睪丸支持細胞缺乏有效的標記方法,因此本實驗的目的是應用BrdU體外標記原代大鼠睪丸支持細胞（sertolicell）,觀察最佳標記時

3、間及標記量,從而為追蹤BrdU標記的睪丸支持細胞移植入體內(nèi)后的存活、生長及分化的動態(tài)變化過程打下基礎?！　?材料和方法　　1.1材料　　SD雄性大鼠（體質(zhì)量約100g,17～22日齡）購于第四軍醫(yī)大學動物試驗中心;DMEMF12培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自Gibco公司,膠原酶、胰酶、BrdU購自Sigma公司;抗BrdU抗體及SABC試劑盒均購自武漢博士德公司?！　?.2方法　　1.2.1大鼠睪丸支持細胞體外分離培養(yǎng)　　取大鼠睪丸,剝除被膜,收集睪丸實質(zhì)于50mL離心管中,4℃900r/min離心4min,傾去上清。按每克睪丸組織加8mL2.5g

4、/L胰蛋白酶,32℃210r/min振蕩、消化30min。加入培養(yǎng)液終止消化,待組織沉降后,棄去上清。重復此步驟3次。再以每克睪丸組織加6mL1g/LⅠ型膠原酶,34℃210r/min振蕩,消化30min。用100目鋼篩過慮收集細胞,900r/min離心10min,收集細胞,用含100mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液洗3次（900r/min,3min）,稀釋細胞至1.5×109/L,接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶。34℃、CO2培養(yǎng)箱中50mL/LCO2培養(yǎng)48h,于倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況（圖1）,吸去培養(yǎng)液后加入20mmol/L,pH7.4的Tris

5、HCl緩沖液低滲處理3min后,用培養(yǎng)液洗滌2次,洗去大部分生精細胞。加入含100mL/L胎牛血清的DMEMF12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),逐日更換培養(yǎng)液并進行觀察?！　?.2.2傳代后大鼠睪丸支持細胞的鑒定　　將培養(yǎng)的支持細胞用2.5g/L胰酶消化并洗滌后,接種到1個6孔板中,并在6孔板中各孔加入1塊經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片,將細胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),待細胞生長于載玻片后,將載玻片取出,在Carnoy中固定12min。950mL/L、700mL/L乙醇、蒸餾水及鹽酸分步漂洗;置于60℃的1mmol/LHCl12min后在冷鹽酸中漂洗;chiff試劑內(nèi)2

6、h;入100mL/L偏重亞硫酸鈉溶液除去非特異染色后,經(jīng)自來水、蒸餾水、700mL/L、950mL/L及1000mL/L乙醇分步洗滌,固綠染色;顯微鏡下觀察并攝片（圖1）。收集培養(yǎng)6～8d的支持細胞,在25g/L戊二醛固定液中預固定,經(jīng)鋨酸后固定、脫水、包埋、半薄切片定位、超薄切片等步驟后,在JEOLJEM1220透射電子顯微鏡下觀察其超微結(jié)構?！　?.2.3BrdU標記方法　　每日觀察細胞生長情況,繪制大鼠睪丸支持細胞生長曲線。以1×105/L將睪丸支持細胞接種于爬片處理的6孔板中,并以終濃度分別為5、10、15、20μmol/L的BrdU檢測

7、睪丸支持細胞的最佳標記劑量;在細胞培養(yǎng)的12、24、36、48h摻入BrdU,使終濃度為15μmol/L,測定BrdU的最佳標記時間;設定正常對照組觀察BrdU有無細胞毒性。隨機數(shù)取10個非重疊視野（×100）,計算BrdU陽性細胞占總細胞數(shù)的比例。　　1.2.4BrdU標記免疫組化染色　　具體步驟如下:（1）PBS清洗標本3次各1min;（2）40g/L多聚甲醛固定30min,PBS沖洗5min,3次;（3）30mL/LH2O2于室溫封閉內(nèi)源性過氧化氫酶30min,PBS沖洗5min,3次;（4）2NHCl于室溫下變性30～45min,使其雙螺旋

8、打開暴露BrdU標記部位。（5）1∶20正常山羊血清封閉20min,甩去多余的液體不洗;（6）抗BrdU一抗（1∶30）4