brdu標(biāo)記在大鼠睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用

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1、BrdU標(biāo)記在大鼠睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用【摘要】目的:探討大鼠睪丸支持細(xì)胞原代培養(yǎng)5溴2脫氧尿苷（BrdU）的最佳標(biāo)記時(shí)間、劑量。方法:大鼠睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng);以終濃度分別為5、10、15、20μmol/L的BrdU檢測(cè)睪丸支持細(xì)胞的最佳標(biāo)記劑量;在細(xì)胞培養(yǎng)的12、24、36、48h摻入BrdU,使終濃度為15μmol/L,測(cè)定BrdU的最佳標(biāo)記時(shí)間;免疫細(xì)胞化學(xué)法跟蹤觀察大鼠睪丸支持細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的分化發(fā)育情況和BrdU標(biāo)記率。結(jié)果:免疫組化檢查提示最終濃度為15μmol/L和孵育36hBrdU標(biāo)記率均>90%,并且

2、連續(xù)傳3代均可檢測(cè)到。結(jié)論:終濃度15μmol/L及孵育36h為BrdU標(biāo)記睪丸支持細(xì)胞的最佳劑量及時(shí)間,表明BrdU標(biāo)記可用于睪丸支持細(xì)胞體內(nèi)后的存活、生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)觀察。【關(guān)鍵詞】睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)BrdU5溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記法作為一種簡(jiǎn)便、敏感、特異的檢測(cè)方法,在醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。BrdU摻入合成的強(qiáng)度可直接顯示細(xì)胞增殖的能力,同時(shí)能避免以往應(yīng)用3HTdR檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的放射性損害[1]。睪丸支持細(xì)胞缺乏有效的標(biāo)記方法,因此本實(shí)驗(yàn)的目的是應(yīng)用BrdU體外標(biāo)記原代大鼠睪丸支持細(xì)胞（sertolicell）,觀察最佳標(biāo)記時(shí)

3、間及標(biāo)記量,從而為追蹤BrdU標(biāo)記的睪丸支持細(xì)胞移植入體內(nèi)后的存活、生長(zhǎng)及分化的動(dòng)態(tài)變化過程打下基礎(chǔ)?！　?材料和方法　　1.1材料　　SD雄性大鼠（體質(zhì)量約100g,17～22日齡）購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心;DMEMF12培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)自Gibco公司,膠原酶、胰酶、BrdU購(gòu)自Sigma公司;抗BrdU抗體及SABC試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司。　　1.2方法　　1.2.1大鼠睪丸支持細(xì)胞體外分離培養(yǎng)　　取大鼠睪丸,剝除被膜,收集睪丸實(shí)質(zhì)于50mL離心管中,4℃900r/min離心4min,傾去上清。按每克睪丸組織加8mL2.5g

4、/L胰蛋白酶,32℃210r/min振蕩、消化30min。加入培養(yǎng)液終止消化,待組織沉降后,棄去上清。重復(fù)此步驟3次。再以每克睪丸組織加6mL1g/LⅠ型膠原酶,34℃210r/min振蕩,消化30min。用100目鋼篩過慮收集細(xì)胞,900r/min離心10min,收集細(xì)胞,用含100mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液洗3次（900r/min,3min）,稀釋細(xì)胞至1.5×109/L,接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶。34℃、CO2培養(yǎng)箱中50mL/LCO2培養(yǎng)48h,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況（圖1）,吸去培養(yǎng)液后加入20mmol/L,pH7.4的Tris

5、HCl緩沖液低滲處理3min后,用培養(yǎng)液洗滌2次,洗去大部分生精細(xì)胞。加入含100mL/L胎牛血清的DMEMF12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),逐日更換培養(yǎng)液并進(jìn)行觀察?！　?.2.2傳代后大鼠睪丸支持細(xì)胞的鑒定　　將培養(yǎng)的支持細(xì)胞用2.5g/L胰酶消化并洗滌后,接種到1個(gè)6孔板中,并在6孔板中各孔加入1塊經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片,將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)于載玻片后,將載玻片取出,在Carnoy中固定12min。950mL/L、700mL/L乙醇、蒸餾水及鹽酸分步漂洗;置于60℃的1mmol/LHCl12min后在冷鹽酸中漂洗;chiff試劑內(nèi)2

6、h;入100mL/L偏重亞硫酸鈉溶液除去非特異染色后,經(jīng)自來水、蒸餾水、700mL/L、950mL/L及1000mL/L乙醇分步洗滌,固綠染色;顯微鏡下觀察并攝片（圖1）。收集培養(yǎng)6～8d的支持細(xì)胞,在25g/L戊二醛固定液中預(yù)固定,經(jīng)鋨酸后固定、脫水、包埋、半薄切片定位、超薄切片等步驟后,在JEOLJEM1220透射電子顯微鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)。　　1.2.3BrdU標(biāo)記方法　　每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,繪制大鼠睪丸支持細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。以1×105/L將睪丸支持細(xì)胞接種于爬片處理的6孔板中,并以終濃度分別為5、10、15、20μmol/L的BrdU檢測(cè)

7、睪丸支持細(xì)胞的最佳標(biāo)記劑量;在細(xì)胞培養(yǎng)的12、24、36、48h摻入BrdU,使終濃度為15μmol/L,測(cè)定BrdU的最佳標(biāo)記時(shí)間;設(shè)定正常對(duì)照組觀察BrdU有無(wú)細(xì)胞毒性。隨機(jī)數(shù)取10個(gè)非重疊視野（×100）,計(jì)算BrdU陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例?！　?.2.4BrdU標(biāo)記免疫組化染色　　具體步驟如下:（1）PBS清洗標(biāo)本3次各1min;（2）40g/L多聚甲醛固定30min,PBS沖洗5min,3次;（3）30mL/LH2O2于室溫封閉內(nèi)源性過氧化氫酶30min,PBS沖洗5min,3次;（4）2NHCl于室溫下變性30～45min,使其雙螺旋

8、打開暴露BrdU標(biāo)記部位。（5）1∶20正常山羊血清封閉20min,甩去多余的液體不洗;（6）抗BrdU一抗（1∶30）4