人cd59 rnai逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定

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1、人CD59RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定：石學(xué)香高美華臧金林【摘要】目的利用siRNA表達(dá)載體法構(gòu)建并篩選攜帶針對(duì)CD59基因pSUPERretroRNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及穩(wěn)定產(chǎn)毒的細(xì)胞克隆。方法用DNA重組技術(shù)，將3條60bp能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向CD59小發(fā)夾RNA（shRNA）的寡核苷酸序列定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPERretro，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系PhoenixA，建立產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞克隆。結(jié)果重組載體經(jīng)PCR及限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定初步成功后測(cè)序序列正確；重組載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，可

2、表達(dá)綠色熒光蛋白，表明包裝成功。結(jié)論特異性沉默CD59基因的pSUPERretroRNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定產(chǎn)毒的細(xì)胞系構(gòu)建成功，為后續(xù)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)，可望為腫瘤治療開(kāi)辟新途徑?！娟P(guān)鍵詞】RNA,雙鏈；抗原,CD59；轉(zhuǎn)染；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體CD59是補(bǔ)體終末段的一種調(diào)節(jié)蛋白，具有抑制補(bǔ)體攻膜復(fù)合物的形成，保護(hù)細(xì)胞免遭補(bǔ)體介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用。FONSATTI等[1]研究顯示，CD59與腫瘤的生長(zhǎng)失控及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由于在大多數(shù)實(shí)體瘤細(xì)胞膜表面存在或者高表達(dá)CD59等一系列的膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，

3、使得腫瘤細(xì)胞逃脫了自身的免疫監(jiān)視以及靶向單克隆抗體治療中由補(bǔ)體介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用，免疫逃逸是導(dǎo)致眾多腫瘤治療方案失敗的重要原因[2,3]。目前，在實(shí)體腫瘤的免疫治療研究中，一個(gè)更加有效的策略是使腫瘤細(xì)胞膜上的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白失活或不表達(dá)。本研究選擇CD59作為靶基因，應(yīng)用RNA干涉（RNAi）技術(shù)，構(gòu)建攜帶針對(duì)CD59的pSUPERretroneo+gfp重組載體，以特異性沉默腫瘤細(xì)胞中CD59基因表達(dá)，觀察小發(fā)夾RNA（shRNA）對(duì)靶基因表達(dá)的抑制作用，以及靶基因沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖的影響。　　1材

4、料與方法　　1.1材料　　逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PhoenixA及pSUPERretroneo+gfp質(zhì)粒均由我院羅兵教授惠贈(zèng)，大腸桿菌JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，靶向CD59的60bpoligos由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司；E.Z.N.A.GelExtractionkit購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司?！　?.2方法　　1.2.1靶向CD59基因寡核苷酸的設(shè)計(jì)應(yīng)用美國(guó)OligoEngine公司提供的雙鏈RNA（siRNA）設(shè)計(jì)軟件，將C

5、D59的基因序列號(hào)輸入后，通過(guò)Blast搜索確認(rèn)與人的基因序列無(wú)同源性，選出3條序列（分別為218～236bp，261～279bp，318～336bp）作為實(shí)驗(yàn)組。按照pSUPER質(zhì)粒說(shuō)明書(shū)中構(gòu)建發(fā)夾狀短鏈RNA的原則，設(shè)計(jì)序列分別為：T1組，5′GATCCCCGCGTGTCTCATTACCAAAGTTCAAGAGACTTTGGTAATGAGACACGCTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAGCGTGTCTCATTACCAAAGTCTCTTGAACTTTGGTAATGAGACACG

6、CGGG3′；T2組，5′GATCCCCGTGTTGGAAGTTTGAGCATTTCAAGAGAATGCTCAAACTTCCAACACTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAGTGTTGGAAGTTTGAGCATTCTCTTGAAATGCTCAAACTTCCAACACGGG3′；T3組，5′GATCCCCTGAGCTAACGTACTACTGCTTCAAGAGAGCAGTAGTACGTTAGCTCATTTTTA3′,As:5′AGCTTAAAAATGAGCTAACGT

7、ACTACTGCTCTCTTGAAGCAGTAGTACGTTAGCTCAGGG3′。同時(shí)設(shè)計(jì)一段錯(cuò)義的19nt作為對(duì)照:C組，5′GATCCCCAGACTTGACTCCTGTCGAATTCAAGAGATCTGAACTGAGGACAGCTTTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAAGACTTGACTCCTGTCGAATCTCTTGAATCTGAACTGAGGACAGCTTGGG3′。　　1.2.2重組載體的構(gòu)建本研究選用美國(guó)OligoEngine公司的pSUPERretro

8、neo+gfp質(zhì)粒作為載體，該載體有BglⅡ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，兩位點(diǎn)之間為長(zhǎng)983bp的填充序列，將該填充序列切下后，與上述合成的具有BglⅡ和HindⅢ黏性末端的60nt的寡核苷酸雙鏈連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒?！　?.2.3重組載體的鑒定PCR初步驗(yàn)證重組載體的正確性，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為包括插入序列及其兩側(cè)部分堿基的一段長(zhǎng)度為395bp的核苷酸，引物序列如下:pSUPERa:5′CCTTTATCCAGCCCTCACTC3′，pSUPER