犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)后細(xì)胞表型變化論文

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1、犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)后細(xì)胞表型變化論文歐陽輝，劉維永，衛(wèi)向陽，顧春虎，宿學(xué)家，鄭奇軍，劉興光【關(guān)鍵詞】,間質(zhì)干細(xì)胞Primarystudyofcellphenotypeofisolatedandculturedcaninebonemarroesenchymalstemcellsinvitro【Abstract】AIM:Toobservethephenotypechangesandbiologicalcharacteristicsofnaturallydifferentiatedcaninebonemarroesenchymal

2、stemcells(BMSCs)anddifferentiatedafterinducedthecaninesbonemarroplification,thegroorphologyicroscopeandsomeantigensinedbyimmunohistochemistrystain.RESULTS:SH2,Vimentin,αSMA,collagenⅠandⅢinindisplayednegativereaction.Theinducedanddifferentiatedcellsshoininn［(50.2±2.5)%］.Th

3、epositiveexpressionofαSMAdecreasedto(42.3±1.6)%andthatofvimentinincreasedto(86.2±2.4)%.CONCLUSION:Thephenotypesandbiologicalcharacteristicsofnaturallydifferentiatedmyofibroblastoreactivethanthoseoffibroblastsandmoresuitabletobeusedasseedcellsinconstructingtissueengineerin

4、gheartvalve(TEHV).【Keyesenchymalstemcells;bonemarromunohistochemistry;canine【摘要】目的：觀察犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）經(jīng)分離、自然擴(kuò)增及誘導(dǎo)分化后表型變化和生物學(xué)特性.方法：利用骨髓穿刺、percoll密度梯度法離心分離繼而貼壁篩選純化BMSCs進(jìn)行接種培養(yǎng)，體外擴(kuò)增；倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化.freelentin,.freelinin的表達(dá)均為陰性.在加入bFGF等誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下，可以誘導(dǎo)分化出成纖維細(xì)胞，其誘導(dǎo)分化率為(50.2±2.5)%.誘導(dǎo)

5、后αSMA表達(dá)陽性率下降為(42.3±1.6)%，vimentin表達(dá)陽性率上升為（86.2±2.4）%，生長擴(kuò)增能力強(qiáng)，2o齡，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供；DMEMLG(DulbeccoEaglesminimumessentialmedium，改良Eagles培養(yǎng)液，低糖型）培養(yǎng)基，新生牛血清（FBS），胰蛋白酶(美國，Gibco公司)；MCDB201培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)專用青、鏈霉素、兩性霉素B混合液，MTT［3(4,5dimethylthiazol2yl)2,5diphenyltertrazoliumbromide四唑鹽］(美國，S

6、igma公司)；percoll分離液(含乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒1.073kg/L，美國，Pharmecia公司)；DMSO(dimethylsulfoxide，二甲基亞砜，美國，Amresco公司)；SH2mAb(Srchomology2，美國，BD公司)；Ⅰ,Ⅲ型膠原mAb(NIDCR惠贈,美國)；Vimentin,αSMA,CD34,Ⅷ因子,LamininmAb，PBS(phosphatebufferedsaline磷酸鹽緩沖液)，PV9000二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京，中山生物技術(shù)有限公司)；倒置相差顯微鏡(德

7、國，Leica公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERAcell，德國，Heraeus公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(美國，μQuant公司)；圖像分析：LeicaQ570c真彩色圖像分析系統(tǒng)(德國，Leica公司)，數(shù)碼攝像機(jī)(JVCky30FBCCD,日本，JVC公司).1.2方法1.2.1細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代無菌條件下通過犬雙側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子穿刺獲取骨髓原液10~15mL/犬，重懸于20mLDMEMLG(含青霉素105u/L，鏈霉素100mg/L，兩性霉素B的混合液25μg/L)，以900g離心10min，棄上清，DMEMLG重懸至6mL/管，混勻；另取

8、10mL離心管，預(yù)加3mLpercoll液，將兩者緩慢疊加，以900g離心30min；取交界白膜層，加DMEMLG洗滌2次；再以含100mL/LFBS，青、鏈霉素、兩性霉素B混合液的DMEML