產(chǎn)纖維素酶真菌的分離和鑒定

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1、產(chǎn)纖維素酶真菌的分離、篩選與鑒定一、采樣地點(diǎn)：深圳大學(xué)杜鵑山深圳大學(xué)文科樓荔枝園深圳大學(xué)文山湖樹叢用具：滅菌信封小鐵鏟小刀分離培養(yǎng)基手套采樣的方法：取采樣地點(diǎn)的表層土或地面15cm下的土樣約10g，裝入信封，立刻到實(shí)驗(yàn)室分離純化二、培養(yǎng)基：（1）馬丁氏培養(yǎng)基：KH2PO41g、MgSO4·7H2O0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂20.0g、水1000ml，pH自然。（2）PDA培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：用于里氏木霉的固體培養(yǎng)，含20%土豆浸出液，1%葡萄糖，2%Agar。20%土豆浸出液作法如下：將土豆去皮切碎，每20g土豆加水100m

2、l，置電爐上煮20分鐘，用紗布過濾，定容。（均需要加入抗生素100mg/ml）產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基（CMC培養(yǎng)基）：羧甲基纖維素鈉（CMC）20.0g、蛋白胨5.0g、酵母抽提物2.0g、NaCl5.0g、KH2PO41.0g、MgSO4·7H2O0.2g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml。1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加熱溶化于100mlpH值4.8，0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中。0.lmol/L的檸檬酸一檸檬酸鈉緩0.1mol/L檸檬酸:含檸檬酸·H2O21.01克/1000毫升。0.1mol/L的檸檬酸三鈉:含檸檬酸三鈉

3、·2H2O29.4克/1000毫升。0.1mol/L的檸檬酸40ml與0.1mol/L的檸檬酸三鈉60.6ml混合即可。剛果紅染液：2%剛果紅溶液。NaCl脫色液：2%氯化鈉溶液。三、實(shí)驗(yàn)方法3.1真菌菌株的分離取土樣方法如前所述。取1.0g所采集的土樣加入到裝有9ml無菌水的試管中，充分振蕩混勻后，吸取上清液作一系列梯度稀釋，10-1，10-2，10-3，將稀釋液涂布在分離培養(yǎng)基（可選擇查氏、馬丁氏或PDA培養(yǎng)基的任兩種，倒平板前加入100mg/ml頭孢菌素或鏈霉素等抗生素），于28℃下培養(yǎng)，待菌落成熟，形成孢子后（約需5-7d）將單菌落

4、上的少量孢子點(diǎn)種至纖維素酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基（CMC平板）平板上(用前加入適量抗生素來抑制細(xì)菌生長),28℃倒置恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)5-7d后用剛果紅染色、NaCl脫色后篩選菌落周圍有明顯透明水解圈的菌株。將篩選到的菌種由平板接到50mL(250mL三角瓶)液體培養(yǎng)基中,于28℃、20r/min下培養(yǎng)24h,制成種子液。然后按5%的接種量將種子液加到50mL(250mL三角瓶)相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，于28℃、210r·min-1條件下培養(yǎng)5-7d,測定CMC酶活。3.2酶活力測定方法3.2.1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線的制作精確稱量0.1g的D-葡萄糖溶于0.05

5、M的檸檬酸緩沖液中，用容量瓶定容到100ml，葡萄糖濃度為1.0mg/ml；將其依次稀釋到0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml，這就是一組標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖溶液；在試管中加入1mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和3mLDNS試劑，沸水浴5分鐘，冷卻至室溫后，加水至25mL，搖勻。以0.05M的檸檬酸緩沖液為空白，在酶標(biāo)儀上測540nm處的OD值；以葡萄糖濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并回歸出工作

6、方程。3.2.2濾紙酶活的測定纖維素酶濾紙酶活力的測定方法是根據(jù)纖維酶能將濾紙酶解成葡萄糖的特性而設(shè)計(jì)。一個FPA國際單位等于酶水解反應(yīng)中每分鐘由濾紙生成1μmol葡萄糖的酶量，以U/mL來表示。取3支25ml的比色管，編號為1，2，3；分別加入1mlpH4.5，0.05M的檸檬酸緩沖液和0.05g的濾紙條；向1號管中加入1ml滅活的上述轉(zhuǎn)化子上清（在沸水中將上清煮沸10min），2號和3號管中加入1ml未滅活的上清；50℃，100r/min振蕩水浴30min；加入3mlDNS，沸水煮沸5min，冷卻后加水定容到25ml；充分混合，取200

7、ml加到96孔酶標(biāo)板上，在酶標(biāo)儀上測540nm處的OD值；根據(jù)預(yù)先作好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線算出酶反應(yīng)過程所釋放的葡萄糖量。3.2.3CMC酶活的測定其酶活定義為每分鐘酶解CMC產(chǎn)生1μmol的還原糖（葡萄糖）所需的酶量定義為一個酶活單位。取3支25ml的比色管，編號為1，2，3；分別加入1ml1%的CMC溶液（用pH4.5，0.05M的檸檬酸緩沖液配制）；向1號管中加入0.5ml滅活的上述轉(zhuǎn)化子上清，2和3號管中加入0.5ml未滅活的上清；50℃，100r/min振蕩水浴15min；加入3mlDNS，沸水煮沸5min，冷卻后加水定容到25ml；

8、充分混合，取200ml加到96孔酶標(biāo)板上，在酶標(biāo)儀上測540nm處的OD值；根據(jù)預(yù)先作好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線算出酶反應(yīng)過程所釋放的葡萄糖量。3.3菌株的鑒定：菌株的鑒定初步采用形態(tài)鑒