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1、黃芪注射液對雌激素受體的激活作用研究論文王海彬，王軍艦，黃輝，劉琳，劉少軍，徐傳毅，何偉，樊粵光.freeltostudytheeffectofAstragalusInjectiononERs.MethodsGenereportsystemplifyingtheligandbindingdomain(LBD)eraseandsubcloningtheproductintotheeukaryoticexpressionvectorpCMVBD.Thissystemployedtostudytherelationshipbe
2、tusingER-LBDisestablished.AstragalusInjectioncannotimprovecellactivitybutcanactivateERsactivation.ConclusionThemechanismsofAstragalusInjectionmayberelatedtoitseffectofactivatingERs.GenereportsystemcanbeusedtostudythemechanismsofChinesetraditionalmedicine.Key；Estr
3、ogenreceptor；HeLacell；Ligandbindingdomain雌激素受體（Estrogenreceptor,ER）是一個核轉(zhuǎn)錄因子,屬甾體激素受體家族成員，調(diào)控基因表達(dá)。ER在1967年被首次發(fā)現(xiàn)［1］，20多年來,它作為內(nèi)分泌治療的預(yù)測因子被廣泛應(yīng)用。1996年ERα首次從大鼠中克隆［2］，其后人和小鼠也相繼發(fā)現(xiàn)ERβ的表達(dá)［3，4］。ERα和ERβ的結(jié)構(gòu)、功能存在差異,.freeline2000購自Invitrogen公司；SteadyGlo熒光檢測試劑盒購自Promega公司；細(xì)胞培養(yǎng)板均購自C
4、orningCostar公司；MTT購自Molecular公司；黃芪注射液(上海禾豐藥業(yè))。1.2PCR擴增hERa-LBDcDNA根據(jù)genebank報道的ERs序列（M12674和NM001437），設(shè)計hERa-LBD和hERb-LBDcDNA序列的引物,在5’端引入一個BamHⅠ的酶切位點,在hERa-LBD的3’端引入一個EcoRⅠ的酶切位點，在hERb-LBD的3’端引入一個HindⅢ的酶切位點，引物序列如下。上游5’GCGGATCCGGAGGGAGAATGTTGAAAC3’下游5’GCGAATTCTCAGA
5、CTGTGGCAGGGAAAC3’；HumanERβLBD引物序列：上游5’GCGGATCCGGCAAGGCCAAGAGAAGTG3’下游5’GCAAGCTTTCACTGAGACTGTGGGTTC3’。以cmxp-ERa和cmxp-ERb全長cDNA質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：94℃,5min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，2min；72℃，7min循環(huán)20次；PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化并回收所需DNA片段,純化的DNA溶解在50μl的TE緩沖液中。1.3哺乳動物
6、細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pCMV-hERLBD的構(gòu)建用BamHⅠ和EcoRI雙酶切PCR產(chǎn)物,瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收純化DNA，加入經(jīng)相同雙酶切處理、凝膠純化回收的pCMV-BD載體，經(jīng)過連接反應(yīng)，構(gòu)建成pCMV-Gal4hERaLBD和pCMV-Gal4hERβLBD質(zhì)粒。反應(yīng)體系為：pCMV-BD2μl(50ng),hERaLBD或hERβLBD6μl(100ng)，10×連接緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl(3U)；16℃過夜連接；將1μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,卡那霉素抗性篩選陽性克隆。小量提取質(zhì)粒,雙
7、酶切消化，1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定陽性重組質(zhì)粒并測定序列。1.4細(xì)胞培養(yǎng)胎牛血清采用Charcoal-strip處理，人子宮癌細(xì)胞系Hela培養(yǎng)在含10%Charcoal-Strip胎牛血清及抗生素（青霉素100U/ml,鏈霉素100μg/ml）的無酚紅DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱濕潤培養(yǎng)。1.5MTT檢測黃芪注射液對Hela細(xì)胞增殖能力的影響細(xì)胞以104個/孔接種至96孔板，分成4組，每組12孔，利用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h之后，向培養(yǎng)液中分別加入不同濃度(0.001%，0.
8、01%，0.1%)的黃芪注射液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用噻唑藍(lán)(MTT)比色法測定細(xì)胞的增殖能力。1.6瞬時轉(zhuǎn)染將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以104/孔傳代于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，長到80%～90%滿時用于轉(zhuǎn)染。用優(yōu)化培養(yǎng)液MEM稀釋lipoFectamine2000試劑（0.5μl/100μl）和質(zhì)粒DNA。優(yōu)化培養(yǎng)液
