冰凍切片實(shí)驗(yàn)步驟

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1、全部實(shí)驗(yàn)步驟1取新鮮組織于4%多聚甲醛固定24小時230%蔗糖脫水48小時以上3-250C包埋（冰凍切片機(jī)內(nèi)）4冰凍切片冰凍切片步驟冰凍切片免疫組化染色步驟：冰凍切片4~8μm，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3次。用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，5分鐘×2次。下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟。(見我發(fā)的前面的帖子)你確定你是冰凍切片嗎？？？冰凍切片不能用熱修復(fù)?。。。∫韵率俏业牟襟E：1冰凍切片室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％

2、過氧化氫孵育5~10分鐘，PBS洗，5分鐘×2。25~10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。3PBS沖洗，5分鐘×3次。4滴加滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘×3次。5滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。6PBS沖洗，5分鐘×3次。7顯色劑顯色（DAB）。8自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。冰凍切片免疫組化染色用的滅活內(nèi)源性過氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室溫

3、20分鐘。此配方不易產(chǎn)生脫片。配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O21ml，混勻后使用，每次新鮮配制。冰凍切片免疫組化染色步驟冰凍切片4~8mm，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2。下接免疫組化染色操作步驟。免疫組化染色步驟：（SP試劑盒為例)1冰凍切片4~8um，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2。25~10％正

4、常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。3PBS沖洗，5分鐘×3次。4滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。PBS沖洗，5分鐘×3次。5滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。6PBS沖洗，5分鐘×3次。7顯色劑顯色（DAB或A

5、EC）。8自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。1.冰凍切片4um左右，室溫25°C復(fù)溫30min，浸入4°C預(yù)冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH為7.2-7.4）在9cm皿內(nèi)搖床沖洗3次，每次5min（第一次沖洗時間短些，約1min后更換）3.用3%過氧化氫一份，純甲醇50份（需要現(xiàn)配，避光條件封閉，可以用紙盒蓋住皿）30min。4.PBS（PH為7.2-7.4，酸性）在9cm皿內(nèi)搖床沖洗3次，每次5min（第一次沖洗時間短些，約1min后更換），甩去PBS，擦干切片周圍的水分，用免疫組化筆或蠟筆在組織周圍畫一適當(dāng)大小的圈，距離組織不宜太

6、近，與切片組織保持5mm左右距離，太近會導(dǎo)致邊緣效應(yīng)。5.5%BSA，室溫孵育20min，期間注意觀察，以免BSA干燥而導(dǎo)致背景太高，請注意在皿內(nèi)玻片兩側(cè)放置浸濕的衛(wèi)生紙或棉球。6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周邊水分，圈內(nèi)可不擦，但盡量要甩干，以免導(dǎo)致抗體濃度不均。7.配置一抗工作液用5%BSA（抗體濃度為1:100），懸空加入一抗工作液50-100ul，槍頭不要觸及組織，以免損傷組織結(jié)構(gòu)，滴加一抗后在水平桌面畫圈方式振蕩，混勻一抗，否則抗體可能附著不勻。8.放入濕盒內(nèi)，置于4°C冰箱過夜（最長不可超過48h），注意蓋蓋，放入后觀

7、察玻片是否處于水平位（否則抗體可能流失，導(dǎo)致玻片組織干掉，出現(xiàn)背景高和假陽性），孵育期間觀察抗體是否干，若干了趕快用PBS清洗浸泡。9.第二天上午取出玻片，置常溫復(fù)溫30min，后PBS沖洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素標(biāo)記的二抗（注意選擇核對一抗來源，抗體加入稀釋后在EP管內(nèi)彈勻，掌上離心機(jī)離心）室溫孵育30min-1h，后PBS沖洗1+5+5+5min。11.滴加1:100比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素PBS稀釋液（SABC）室溫1h，后PBS沖洗1+5+5+5min，甩干，以免顯色不均。12.DAB顯色

8、，顯色時放置在白色紙上，觀察顯色程度以終止DAB反應(yīng)，最好把玻片置于顯微鏡上找到可能的陽性顯色區(qū)域滴加DAB，觀察到陽性區(qū)和陰性區(qū)差異后終止，此時最好有計時，以便于今后重復(fù)試驗(yàn)控制顯色時間（一般顯色時間2s