冰凍切片實(shí)驗(yàn)步驟

冰凍切片實(shí)驗(yàn)步驟

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時間:2018-04-24

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1、全部實(shí)驗(yàn)步驟1取新鮮組織于4%多聚甲醛固定24小時230%蔗糖脫水48小時以上3-250C包埋(冰凍切片機(jī)內(nèi))4冰凍切片冰凍切片步驟1.冰凍切片4um左右,室溫25°C復(fù)溫30min,浸入4°C預(yù)冷的丙酮固定10min,2.PBS(PH為7.2-7.4)在9cm皿內(nèi)搖床沖洗3次,每次5min(第一次沖洗時間短些,約1min后更換)3.用30%過氧化氫一份,純甲醇50份(需要現(xiàn)配,避光條件封閉,可以用紙盒蓋住皿)30min。4.PBS(PH為7.2-7.4,酸性)在9cm皿內(nèi)搖床沖洗3次,每次5min(第一次沖洗時間短些,約1min后更換),甩去PBS

2、,擦干切片周圍的水分,用免疫組化筆或蠟筆在組織周圍畫一適當(dāng)大小的圈,距離組織不宜太近,與切片組織保持5mm左右距離,太近會導(dǎo)致邊緣效應(yīng)。5.5%BSA,室溫孵育20min,期間注意觀察,以免BSA干燥而導(dǎo)致背景太高,請注意在皿內(nèi)玻片兩側(cè)放置浸濕的衛(wèi)生紙或棉球。6.甩去血清,PBS洗1min,擦干周邊水分,圈內(nèi)可不擦,但盡量要甩干,以免導(dǎo)致抗體濃度不均。7.配置一抗工作液用5%BSA(抗體濃度為1:100),懸空加入一抗工作液50-100ul,槍頭不 要觸及組織,以免損傷組織結(jié)構(gòu),滴加一抗后在水平桌面畫圈方式振蕩,混勻一抗,否則抗體可能附著不勻。8.放

3、入濕盒內(nèi),置于4°C冰箱過夜(最長不可超過48h),注意蓋蓋,放入后觀察玻片是否處于水平位(否則抗體可能流失,導(dǎo)致玻片組織干掉,出現(xiàn)背景高和假陽性),孵育期間觀察抗體是否干,若干了趕快用PBS清洗浸泡。9.第二天上午取出玻片,置常溫復(fù)溫30min,后PBS沖洗1+5+5+5min,10.滴加1:100生物素標(biāo)記的二抗(注意選擇核對一抗來源,抗體加入稀釋后在EP管內(nèi)彈勻,掌上離心機(jī)離心)室溫孵育30min-1h,后PBS沖洗1+5+5+5min。11.滴加1:100比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素PBS稀釋液(SABC)室溫1h,后PBS沖洗1

4、+5+5+5min,甩干,以免顯色不均。12.DAB顯色,顯色時放置在白色紙上,觀察顯色程度以終止DAB反應(yīng),最好把玻片置于顯微鏡上找到可能的陽性顯色區(qū)域滴加DAB,觀察到陽性區(qū)和陰性區(qū)差異后終止,此時最好有計時,以便于今后重復(fù)試驗(yàn)控制顯色時間(一般顯色時間2s-10min,顯色時間過長背景高,且可靠性低)13.終止DAB顯色可將玻片置于染色缸內(nèi),用自來水流水稀釋終止5min,后在顯微鏡下觀察是否有DAB顆粒附著。14. 甩干水分,蘇木素復(fù)染(如為加汞的蘇木素,顯色時間為6-10s,可不用酒精分化,直接用PBS返藍(lán),如為非加汞蘇木素,需在鹽酸酒精分化

5、),蘇木素終止亦可用自來水沖洗終止反應(yīng)。15.水洗后梯度酒精脫水二甲苯透明(75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2)個3min,滴加中性樹膠封片,中性樹膠濃度以不拉絲為宜16.封片后干燥1h(或者在通風(fēng)櫥吹風(fēng)的情況下15min),用棉球沾濕二甲苯擦去溢出的樹膠?!∮^察照相。針對脫片問題,我做了如下處理。但仍存在脫片現(xiàn)象,麻煩您給我提一些相關(guān)的建議。自來水沖洗玻片,晾干后,多聚賴氨酸的涂膠以下兩種方法我都試過1.單涂膠:往一張玻片上加0.01%的多聚賴氨酸80ul,用另一張玻片推片,然后疊加其上,停留5分鐘,中間推動玻片數(shù)次,使

6、液體涂抹均勻,分開兩張玻片,濾紙吸干玻片下緣,置玻片架上600C烤干1h備用。2.雙涂膠:往一張玻片上加0.01%多聚賴氨酸80ul,單涂膠600C烤干,同樣方法重復(fù)涂膠1次"600C烤干,備用。

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