冰凍切片免疫組化步驟.doc

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1、冰凍切片免疫組化步驟1.需要準備的材料APES包被的載玻片PBS（pH7.4）4%多聚甲醛PBST（含Tween-20）PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸）2.冰凍切片取出組織塊放于軟塑料蓋或特制的小盒內(nèi)，之后將其緩慢平放于盛有液氮的小杯內(nèi)，讓盒底部接觸液氮（小盒及組織塊切勿浸入液氮內(nèi)），大約10-20秒組織即迅速冰凍成塊。取出組織冰塊立即置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?，或置于恒溫切片機冰凍切片。切片厚度4-8um(5um)，對于免疫組化的需要用APES包被的載玻片，以增加組織片的粘附性。切片后如不立即染色，必須吹干，儲存于低溫

2、冰箱內(nèi)保存。3.免疫組化染色步驟固定：取出切片，室溫放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室溫固定15mins，PBS沖洗三次（沖洗可以采用側(cè)斜淋洗，也可至于平皿中搖晃）。打孔：如果是需要染細胞內(nèi)的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：組織樣品浸于含0.25%TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。封閉：將組織置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封閉非特異性粘合的抗體。對于多聚甲醛固定并進行免疫熒光的樣本，在封閉緩沖液中加入0.

3、3mol/L的甘氨酸。孵化：組織樣本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀釋），放于濕盒中，室溫1h或4℃過夜。用PBS洗3次，每次5mins。浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室溫1h。PBS洗3次，每次5mins。染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。封片：用蓋玻片封片，指甲油固定，保存與4或-20℃。