紙層析法分析氨基酸

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1、實(shí)驗(yàn)二、紙層析法分析氨基酸一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握紙上層析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性顏色反應(yīng)。3.學(xué)會(huì)分析未知樣品的氨基酸成分。紙上層析法是分配層析法中的一種，常以濾紙為惰性支持物。紙上層析法是分離、鑒定和定量測(cè)定氨基酸、糖類、抗生素等有機(jī)物質(zhì)的一項(xiàng)重要而簡便的分析方法。所用設(shè)備簡單、操作方便，使用樣品少，分離效果好，為近代生物化學(xué)分析中重要技術(shù)之一。此法廣泛地應(yīng)用于科研和生產(chǎn)分析工作中。二、實(shí)驗(yàn)原理常以水和有機(jī)溶劑作為展層劑；水和有機(jī)溶劑互溶后形成兩個(gè)相：一個(gè)是飽和了有機(jī)溶劑后的水相,一個(gè)是飽和了水后

2、的有機(jī)溶劑相。由于濾紙纖維素上的羥基和水分子有較大的親和力,其吸附的水相為固定相,有機(jī)溶劑相為移動(dòng)相。由于物質(zhì)的極性大小不同,在兩相中分配比例有所差異。極性小的物質(zhì)在有機(jī)相中分配較多,隨有機(jī)相移動(dòng)較快；而極性大的物質(zhì)在水相中分配較多,移動(dòng)相對(duì)較慢,從而將極性不同的物質(zhì)分開紙上層析的原理在相同的條件下，每種物質(zhì)都有其固定的Rf值。Rf值的定義為：原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離Rf=原點(diǎn)到溶劑前沿的距離影響Rf值的因素有：①物質(zhì)本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)；②展層所用溶劑系統(tǒng)；③展層劑pH值；④展層時(shí)的溫度；⑤展層所用濾紙；⑥展層的方向(橫

3、向，上行或下行)。用紙層析鑒定樣品時(shí)，一般都與標(biāo)準(zhǔn)品相比較。若沒有標(biāo)準(zhǔn)品，可選擇文獻(xiàn)記載的該物質(zhì)層析條件，根據(jù)文獻(xiàn)Rf值進(jìn)行鑒定。三、實(shí)驗(yàn)操作1、紙的處理取18cm長、18cm寬的濾紙一張，離底邊2cm處用鉛筆輕輕劃一條與底邊平行的線，并等距離的在線上定點(diǎn)樣點(diǎn)(原點(diǎn))劃圈，使圈的直徑小于0.4cm。2、點(diǎn)樣用毛細(xì)管點(diǎn)樣，中間點(diǎn)混合氨基酸，兩側(cè)點(diǎn)三種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸；每個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)重復(fù)點(diǎn)2-3次，每點(diǎn)一次用電吹風(fēng)吹干后再點(diǎn)下次（此時(shí)，用冷風(fēng)吹干，防止氨基酸變性降解），點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑應(yīng)控制在2-4mm左右，點(diǎn)樣完畢用大頭針線將濾紙做

4、成筒形，點(diǎn)樣面向里。圖1.點(diǎn)樣2cm展層劑展層劑圖2.濾紙的縫合3、平衡點(diǎn)樣以后將濾紙與層析缸用配好的溶劑系統(tǒng)蒸汽來飽和，這個(gè)過程稱為平衡(30min),否則，濾紙會(huì)從溶劑中吸收水分，溶劑也會(huì)從濾紙表面揮發(fā)，使溶劑系統(tǒng)的組分發(fā)生改變，嚴(yán)重時(shí)紙上會(huì)出現(xiàn)不同水平的溶劑前沿，影響層析效果。4、展層向?qū)游龈字屑尤雽游鋈軇ǜ呒s1.5cm），液層不要超過點(diǎn)樣線，將濾紙點(diǎn)樣點(diǎn)朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達(dá)濾紙上邊線1-2cm時(shí)取出冷風(fēng)吹干。5、顯色用噴霧器向?yàn)V紙上均勻噴灑0.1%茚三酮，熱風(fēng)吹干(加快反應(yīng))反應(yīng)顯色

5、(或晾干后，將濾紙放入烘箱中80-100℃，烘烤5分鐘后)，濾紙上即顯出紫紅色或黃色的氨基酸斑點(diǎn)。四、結(jié)果處理1、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點(diǎn)描出來。2、測(cè)量原點(diǎn)至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計(jì)算各種已知氨基酸和未知氨基酸色譜的Rf值。3、分析混合樣品中未知氨基酸的組分。圖3.層析譜1．原點(diǎn)；2．層析點(diǎn)；3．溶劑前沿五、注意事項(xiàng)(1)在整個(gè)操作過程中，手只能接觸濾紙邊緣，否則手指上的氨基酸會(huì)造成濾紙上眾多斑點(diǎn)。(2)在點(diǎn)樣時(shí)，不要將毛細(xì)管插錯(cuò)了試劑瓶。(3)點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大（其直徑應(yīng)小于0.5cm），防止氨基酸斑點(diǎn)重

6、疊。(4)展層劑接觸濾紙時(shí)一定要均勻、保持前沿線與濾紙平行。(5)吹風(fēng)溫度不宜過高，否則斑點(diǎn)變黃。(6)展層結(jié)束后，切勿忘記用鉛筆描出溶劑前沿。