氨基酸紙層析法

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1、實(shí)驗(yàn)二氨基酸紙層析法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)并了解分配層析的原理；v2、掌握紙層析法分離氨基酸的原理和步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析法（paperchromatography）是生物化學(xué)上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測(cè)定。紙層析法又稱紙色譜法，是用濾紙為支持物，所用展層溶劑大多由水和有機(jī)溶劑組成，濾紙纖維與水的親和力強(qiáng)，與有機(jī)溶劑的親和力弱，因此在展層時(shí)，紙纖維上吸附的水分是固定相，有機(jī)溶劑是流動(dòng)相。溶劑由下向上移動(dòng)的，稱上行法；由上向下移動(dòng)的，稱下行法。將樣品點(diǎn)

2、在濾紙上(此點(diǎn)稱為原點(diǎn))，進(jìn)行展層，樣品中的各種氨基酸在兩相溶劑中不斷進(jìn)行分配。由于它們的分配系數(shù)不同，不同氨基酸隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率就不同，于是就將這些氨基酸分離開來(lái)，形成距原點(diǎn)距離不等的層析點(diǎn)。溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速率用Rf值表示：v：vv在一定條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、溫度、濕度、層析濾紙的型號(hào)和質(zhì)量等因素有關(guān)。只要條件(如溫度、展層溶劑的組成)不變，Rf值是常數(shù)，故可根據(jù)Rf值作定性判斷。樣品中如有多種氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此時(shí)如

3、只用一種溶劑展層，就不能將它們分開。為此，當(dāng)用一種溶劑展層后，將濾紙轉(zhuǎn)動(dòng)90度，再用另一溶劑展層，從而達(dá)到分離目的，這種方法稱為雙向紙層析法。氨基酸無(wú)色，可利用茚三酮顯色反應(yīng)，將氨基酸層析點(diǎn)顯色作定性、定量用。所有氨基酸及具有游離α-氨基的肽與茚三酮反應(yīng)都產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì)，只有脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生（亮）黃色物質(zhì)。三、藥品器材1實(shí)驗(yàn)器材濾紙、燒杯10ml(×1)、剪刀、層析缸（×2）、毛細(xì)血管、電吹風(fēng)（×1）2實(shí)驗(yàn)試劑(1)氨基酸溶液：賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸溶液以及他們的混合溶液(2

4、)溶劑系統(tǒng)堿相溶劑：V[正丁醇（A.R.）]:V(12％氨水):V(95％乙醇)=13:3:3酸性溶劑:V[正丁醇（A.R.）]:V(80％甲酸):V(水)=15:3:2(3)顯色貯備液:V(0.4mol/茚三酮-異丙醇):V(甲酸):V(水)=20:1:5.四、實(shí)驗(yàn)方法1.濾紙準(zhǔn)備：選用新華1號(hào)濾紙，裁成24cm×28cm的長(zhǎng)方形，在距紙一端2cm處用鉛筆輕輕劃一基線，在線上每隔3cm，畫一小點(diǎn)樣的原點(diǎn)。2.點(diǎn)樣：氨基酸點(diǎn)樣量以每種氨基酸含5-20ug為宜，用微量注射器或微量吸管，吸取氨基酸樣品1

5、0ul點(diǎn)于原點(diǎn)(分批點(diǎn)完)，用吹風(fēng)機(jī)稍加吹干后再點(diǎn)下一次，重復(fù)2～3次，點(diǎn)子直徑不能超過(guò)0.5cm。3.展層和顯色：將點(diǎn)好樣的濾紙，用白線縫好，制成圓筒，原點(diǎn)在下端，浸立在培養(yǎng)皿內(nèi)，不需平衡，立即展層，展層劑為酸性溶劑系統(tǒng)[V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15:3:2]，把展層劑混勻，倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，同時(shí)加入顯色貯備液(每10ml展層劑加0.1-0.5ml的顯色貯備液)進(jìn)行展層，當(dāng)溶劑展層至距濾紙上沿1-2cm時(shí)。4.顯色：展層畢，取出濾紙，用熱風(fēng)吹干，藍(lán)紫色斑點(diǎn)即顯現(xiàn)。5.結(jié)果：用鉛筆輕輕描出顯

6、色斑點(diǎn)的形狀，并用一直尺度量每一顯色斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)之間的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，計(jì)算各色斑的Rf值，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的Rf值對(duì)照，確定混合物中含有哪些氨基酸。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、問(wèn)題與討論1．紙層析法的原理是什么？紙層析法依據(jù)極性相似相溶原理，是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。由于樣品中各物質(zhì)分配系數(shù)不同，因而擴(kuò)散速度不同，從而達(dá)到分離的目的。同時(shí)，運(yùn)用茚三酮顯色反應(yīng)達(dá)到分離、鑒定氨基酸的目的。2．何謂Rf值？影響Rf值的主要因素是什么？試樣經(jīng)層析后可用比移值（Rf）表示各組成成分的

7、位置（比移值=原點(diǎn)中心至色譜斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)中心至流動(dòng)相前沿的距離之比），在一定條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、溫度、濕度、層析濾紙的型號(hào)和質(zhì)量等因素有關(guān)。只要條件(如溫度、展層溶劑的組成)不變，Rf值是常數(shù)，故可根據(jù)Rf值作定性判斷。