加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長因子β1、結締組織生長因子mrna影響的研究

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1、加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長因子β1、結締組織生長因子mRNA影響的研究作者：鄭旭銳，葉建紅，周新穎，楊宇，孫守才【摘要】　　目的觀察加味四逆散對肝臟轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）、結締組織生長因子（CTGF）mRNA的影響，探討其抗肝纖維化的作用機制。方法采用二甲基亞硝胺腹腔注射制備大鼠肝纖維化模型，加味四逆散灌胃給藥，采用實時定量PCR技術檢測各組大鼠肝組織TGFβ1和CTGFmRNA表達的水平。結果加味四逆散能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織TGFβ1和CTGFmRNA水平，與病理模型組比較有顯著性差異（P<0.05）。結論加味四逆散能夠降低肝組織TGF

2、β1和CTGFmRNA表達，從而發(fā)揮其抗纖維化的作用。【關鍵詞】加味四逆散肝纖維化肝臟轉(zhuǎn)化生長因子結締組織生長因子　　加味四逆散是治療慢性病毒性肝炎的有效經(jīng)驗方，既往的臨床觀察和動物實驗研究已經(jīng)證實該方具有良好的防治肝纖維化作用［1～3］。本實驗采用二甲基亞硝胺（DMN）腹腔注射誘導肝纖維化大鼠動物模型，應用實時定量PCR技術檢測大鼠肝組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ71）、結締組織生長因子（CTGF）mRAN表達，探討加味四逆散抗肝纖維化的作用機制?！　?材料　　1.1動物SD大鼠60只，雄性，清潔級，體重(180±20)g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心購進?！　?.2藥

3、品及試劑加味四逆散煎劑由柴胡、枳殼、白芍、甘草、黃芪、丹參、桃仁等藥組成，自陜西中醫(yī)學院附院藥房購進，經(jīng)本院藥物鑒定教研室鑒定無偽劣品。藥物加水浸泡常規(guī)煎煮，過濾，水浴蒸發(fā)至每毫升含生藥3.5g，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩６谆鶃喯醢?Sigma公司)。秋水仙堿（云南醫(yī)藥集團云南藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20020208）、TRIzolRegent（Invitrogen公司）、RT-PCRKit（大連寶生物工程有限公司）?！　?方法　　2.1動物模型制備大鼠在適應性飼養(yǎng)1周后隨機選取12只作為空白對照組（A組），其余48只均用DMN（用生理鹽水稀釋至5mg/ml）以10ml/kg體

4、重腹腔注射，1次/d，每周連續(xù)3d，連續(xù)4周?！　?.27分組4周造模結束后，48只大鼠共死亡8只，死亡率為16.7%，將剩余40只造模大鼠隨機分為：病理模型組（B組）16只，秋水仙堿組（C組）12只，中藥治療組（D組）12只?！　?.3給藥A、B組：以生理鹽水4ml/只灌胃；C組：以秋水仙堿0.01mg/kg體重灌胃；D組：以加味四逆散煎劑10ml/kg體重灌胃。以上各組用藥均1次/d，連續(xù)用藥30d后結束?！　?.4標本制作實驗結束后取部分新鮮肝組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm?！　?.5普通病理組織學觀察病理組織學分級標準為［4］：“-”級:正常肝臟

5、或無明顯膠原纖維增生；“±”級：膠原纖維增生，中央靜脈和匯管區(qū)有少量纖維索放散延伸，但無間隔形成；“+”級：膠原纖維增生，中央靜脈和匯管區(qū)結締組織變厚，由此向四周伸出纖維索，形成不完全間隔；“++”級：膠原纖維大量增生，有個別菲薄的完全間隔形成（假小葉）；“+++”級：完全間隔較厚，假小葉大量形成?！　?.6RNA抽提和RT反應實驗結束后取部分新鮮肝組織，按照Trizol試劑說明提取總RNA，加入20μlDEPC-treated水溶解，用紫外分光光度計260/280進行樣品的濃度測定和質(zhì)量鑒定，電泳證實總RNA的完整性。取2μg總RAN，按試劑盒(大連寶生物工程有限公司，RT

6、-PCRKit)說明書進行操作，合成cDNA。7　　2.7實時定量PCR（Real-timePCR）根據(jù)目的基因在Genbank中的已知序列用primerpremier5.0設計引物，由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列見表1。表1PCR中應用的引物序列（略）　　2.8統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)應用SPSS10.0軟件處理,參數(shù)值用±s表示,組間比較采用ｔ檢驗（P<0.05為有顯著性差異）?！　?結果　　3.1加味四逆散對大鼠癥狀表現(xiàn)的影響實驗期間空白組大鼠一直精神狀態(tài)佳，皮毛光滑密澤，大便正常，進食無異常。所有造模組大鼠，則出現(xiàn)不同程度的精神不振，反應遲鈍，飲食攝水明顯減少

7、，糞便稀薄，皮毛凌亂，缺乏光澤；治療組于治療3周后，大便逐漸干燥，進食、攝水增加，精神狀態(tài)亦隨之好轉(zhuǎn)。實驗過程中模型組大鼠死亡5只，可能為肝纖維化進行性加重而死亡?！　?.2加味四逆散對肝纖維化組織病理學的影響實驗結束后，光鏡下觀察可見：空白對照組：HE染色見肝組織結構清晰，膠原纖維染色僅于匯管區(qū)和中央靜脈有少許膠原纖維存在。模型組：HE染色見肝組織結構欠清晰7，匯管區(qū)及小葉內(nèi)中度炎性細胞浸潤；膠原纖維染色顯示匯管區(qū)大量膠原沉積，呈較寬的條索狀纖維深入肝小葉。各治療組大鼠僅見輕度匯管區(qū)炎癥，膠原纖維染色