垂盆草醇提物對人肝癌細(xì)胞hepg2的抑制作用及其機(jī)制初探

《垂盆草醇提物對人肝癌細(xì)胞hepg2的抑制作用及其機(jī)制初探》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、垂盆草醇提物對人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用及其機(jī)制初探【摘要】目的：觀察垂盆草醇提物(CCW)對人肝癌細(xì)胞HepG2生長及其腫瘤相關(guān)分子指標(biāo)的影響。方法：MTT法測定CCW對HepG2細(xì)胞增殖的作用;流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期的改變;分別用RTPCR及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測CCW對VEGF、cMyc基因及蛋白水平的影響。結(jié)果：HepG2細(xì)胞的增殖在CCW作用的第24、48和72h均被顯著地抑制;CCW(100、200μg·ml-1)可使HepG2細(xì)胞阻滯于G0/G1期;CCW可顯著下調(diào)VEGF、cMyc的mRNA及蛋白水平

2、的表達(dá)。結(jié)論：CCW對HepG2細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并且能阻止細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，這可能與cMyc基因表達(dá)的下調(diào)密切相關(guān);CCW能抑制HepG2細(xì)胞的VEGF分泌，初步推測CCW具有抗血管生成作用?！娟P(guān)鍵詞】垂盆草;肝癌;抗增殖;細(xì)胞周期;抗血管生成垂盆草(SedumsarmentosumBunge)又稱臥莖景天，系景天科多年生草本植物，分布于全國大部分地區(qū)。垂盆草主要含有垂盆草苷類、黃酮類、三萜類、甾醇、生物堿及糖類。此藥性涼，味甘、淡，新鮮或干燥全草入藥，主要用于治療濕熱黃疽、小便不利、癰腫瘡瘍，并且具有抑制

3、炎性滲出，減少肝細(xì)胞損傷，降低血清丙基酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平，治療急、慢性肝炎等功效[1]。近年來，國內(nèi)外大量研究表明，慢性病毒性肝炎與肝癌(hepatocellular14carcinoma)的發(fā)生有著密切的聯(lián)系[23]，一些傳統(tǒng)中草藥中的黃酮、生物堿及多糖等成分在抗腫瘤、延長患者生命等方面有著獨特的生物活性，不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，還能有效抑制血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和原癌基因cMyc的表達(dá)[47]，而VEGF和cMyc在肝癌的形成、生長、浸潤、轉(zhuǎn)

4、移過程中均發(fā)揮著重要的作用[8]。因此，本研究著重觀察垂盆草醇提物(CCW)對人肝癌細(xì)胞HepG2生長及腫瘤相關(guān)基因VEGF和cMyc表達(dá)的影響。　　1材料與方法　　1.1材料　　垂盆草購于江蘇省藥材公司。MTT、蛋白酶(Sigma公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，BiozolRNA提取劑(BioFlux公司)，MMLV酶、TaqDNA聚合酶(Promega公司)，VEGF、cMyc和βactin引物由InvitrogenBiotechnolog

5、yCo.,Ltd.(上海)合成，兔抗人VEGF、cMyc抗體、生物素化羊抗兔IgG、SABC試劑盒、DAB檢驗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱MCO15AC(Sanyo公司)，真空冷凍干燥機(jī)(MatinChrist公司)，酶標(biāo)儀(BioTek公司)，PTC200PCR儀(BioRad公司)，GelDocEQ圖像分析儀(BioRad公司)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickson公司)。14　　1.2方法　　1.2.1垂盆草醇提物的制備垂盆草干草50

6、0g，于95%的乙醇5000ml中浸泡5d，紗布過濾，收集藥液。重復(fù)2次，合并藥液，離心取上清，所得上清液經(jīng)減壓蒸發(fā)揮去溶劑，再用石油醚經(jīng)索氏提取法去除脂類，揮去石油醚,再用甲醇溶解，減壓蒸干得醇提物?！　?.2.2細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2于含10%小牛血清、青霉素100U·ml-1、鏈霉素150μg·ml-1的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?！　?.2.3細(xì)胞增殖能力的檢測將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105ml-1，接種于96孔板，80μl·孔-1，3h貼壁后加入終質(zhì)

7、量濃度分別為25、50、100、200μg·ml-1的CCW，同時設(shè)0.1%DMSO對照組，每組設(shè)6個平行孔，將培養(yǎng)板置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72h后MTT法檢測[9]?！　?.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期取對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)成濃度為2×105ml-1，300μl·孔-1接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后加入質(zhì)量濃度分別為50、100、200μg·14ml-1的CCW，對照組加含0.1%DMSO的同體積培養(yǎng)液，設(shè)4個復(fù)孔。分別收集對照組和醇提物各劑量作用48h后的HepG2細(xì)胞1×106個，70%乙醇4℃固

8、定過夜，PBS清洗，加入含2%TritonX100、50μg·ml-1RNaseA的PI溶液，4℃避光染色30min,上機(jī)檢測2×104個細(xì)胞，用WinMDI分析軟件分析結(jié)果。　　1.2.5RTPCR檢測肝癌細(xì)胞的VEGF和cMyc的mRNA水平用Biozol試劑分別提取各組HepG2細(xì)胞的總RN