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1、淀粉酶活力測定實驗報告實驗三、淀粉酶活性的測定實驗報告實驗四、淀粉酶活性的測定一、實驗目的：1、了解α-淀粉酶和β-淀粉酶的不同性質(zhì)及其淀粉酶活性測定的意義；2、學會比色法測定淀粉酶活性的原理及操作要點。二、實驗原理：淀粉酶存在于幾乎所有植物中，特別是萌發(fā)后的禾谷類種子，淀粉酶活力最強，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根據(jù)α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化；β-淀粉酶不耐熱，70℃15min則被鈍化。測定時，使其中一種酶失活，即可測出另一種酶的活性。淀粉在淀粉酶的催化作用下
2、可生成麥芽糖，利用麥芽糖的還原性與3,5-二硝基水楊酸反應生成棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸，測定其吸光度，從而確定酶液中淀粉酶活力（單位重量樣品在一定時間內(nèi)生成麥芽糖的量）。三、實驗用具：1、實驗設備研缽,具塞刻度試管,離心管，分光光度計，酸度計，電熱恒溫水浴鍋，離心機，電磁爐。2、實驗材料與試劑（1）0.1mol/lpH5.6的檸檬酸緩沖液：A液：稱取檸檬酸20.01g，定容至1000ml；B液：稱取檸檬酸鈉29.41g，定容至1000ml；取A液55ml與B液145ml混勻。（2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉
3、溶于100ml0.1mol/lpH5.6的檸檬酸緩沖液；（3）1%3,5-二硝基水楊酸試劑：稱取3,5-二硝基水楊酸1g、NaOH1.6g、酒石酸鉀鈉30g，定容至100ml水中，緊蓋瓶塞，勿使CO2進入；（4）麥芽糖標準溶液：取麥芽糖0.1g溶于100ml水中；（5）pH6.8的磷酸緩沖液:取磷酸二氫鉀6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至1000ml即得。（6）0.4mol/L的NaOH溶液；（7）1%NaCl溶液。（8）實驗材料：萌發(fā)的谷物種子（芽長約1c
4、m）四、操作步驟1、酶液提取：取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL1%的NaCl溶液，磨碎后以2000r/min離心10min，轉(zhuǎn)出上清液備用。取上清液1.0ml，用pH為6.8的緩沖溶液稀釋5倍，所得酶液。2、a-淀粉酶活力測定(1)取試管4支,標明2支為對照管,2支為測定管。(2)于每管中各加酶液lml,在70℃士0.5℃恒溫水浴中準確加熱15min,取出后迅速用流水冷卻。(3)在對照管中加入4m10.4mol/L氫氧化鈉。(4)在4支試管中各加入1mlpH5.6的檸檬酸緩沖液。(5)將4支試管置另一
5、個40℃士0.5℃恒溫水浴中保溫15min,再向各管分別加入40℃下預熱的1％淀粉溶液2m1,搖勻,立即放入40℃恒溫水浴準確計時保溫5min。取出后向測定管迅速加入4ml0.4mol/L氫氧化鈉,終止酶活動,準備測糖。3、淀粉酶總活力測定:取酶液5ml,用蒸餾水稀釋至100m1,為稀釋酶液。另取4支試管編號,2支為對照,2支為測定管，然后加入稀釋之酶液lml，在對照管中加入4m10.4mol氫氧化鈉，4支試管中各加1mlpH5.6的檸檬酸緩沖液。以下步驟重復α-淀粉酶測定第（5）步的操作,同樣準備測糖。4、麥芽糖
6、的測定(1)標準曲線的制作:取25ml刻度試管7支,編號.分別加入麥芽糖標準液（lmg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml,然后用吸管向各管加蒸餾水使溶液達2.0ml,再各加3,5一二硝基水楊酸試劑2.0m1,置沸水浴中加熱10min.取出冷卻,用蒸餾水稀釋至25m1?；靹蚝笥梅止夤舛扔嬙?20nm波長下進行比色,記錄吸光度，以吸光度為縱坐標,以麥芽糖含量（mg）為橫坐標,繪制標準曲線。(2)樣品的測定:取步驟2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分別放入相應的8支25ml具塞刻度試管中,各加
7、入2m13,5-二硝基水楊酸試劑.以下操作同標準曲線制作。根據(jù)樣品比色吸光度平均值,從標準曲線查出麥芽糖含量,最后進行結(jié)果計算。五、結(jié)果處理式中A為a-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖（mg）；Ao為a-淀粉酶的對照管中麥芽糖量（mg）；B為（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖（mg）；Bo為（a十β）淀粉酶的對照管中麥芽糖（mg）；VT為樣品稀釋總體積（ml）；VU為比色時所用樣品液體積（ml）；NaOH溶液、萌發(fā)的小麥種子2.實驗步驟（1）初始酶液的制取（30min）2g萌發(fā)的小麥種子→少量石英砂，研磨至勻漿→少
8、量多次用蒸餾水轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶至40ml→顛倒浸提15~20min→定容至刻度→混勻→3500r/min離心20min→上清液（2）α-淀粉酶活性的測定（50min）取所制取的酶液5ml，放入100ml容量瓶中，定容至刻度，混合均勻得到稀釋后酶液。（4）麥芽糖含量的測定α-淀粉酶活性（mg麥芽糖·min-1·g-1鮮重）=[（A-A’）×樣品稀釋總體積]
