klotho蛋白對帕金森病模型小鼠的神經(jīng)保護作用

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1、Klotho蛋白對帕金森病模型小鼠的神經(jīng)保護作用【摘要】目的觀察Klotho蛋白對1甲基4苯基1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)所致C57BL/6小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護作用，并探討其可能的保護機制。方法C57BL/6小鼠分4組：野生型(PTP(PTP)組，Klotho蛋白高表達型(KO)生理鹽水對照組(KO+NS)，Klotho蛋白高表達型MPTP組(KO+MPTP)。PTP組和KO+MPTP組小鼠皮下注射MPTP(20mg/kg)，連用2d制備帕金森病(PD)模型;PTP組黑質(zhì)致密帶(SNc)TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目較KO+NS組有所減少，但差異不顯

2、著;而PTP組SNc區(qū)TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目較PTP組小鼠Str區(qū)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC含量較KO+NS減少，但差異不顯著，HVA含量的改變差異顯著(P<0.05);而PTP組DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA含量較PTP對小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷，其機制可能因為Klotho蛋白是成纖維細胞生長因子23(FGF23)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中其受體的基本輔助因子及抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】Klotho蛋白;帕金森病;多巴胺能神經(jīng)元;黑質(zhì)帕金森病(PD)又稱震顫麻痹，是一種多發(fā)于65歲以上人群、男性略多于女性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其最主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密帶(

3、SNc)多巴胺(DA)能神經(jīng)元進行性變性、脫失及伴發(fā)的紋狀體軸突末梢DA耗竭，最終造成PD特有的運動功能障礙，其典型癥狀為靜止震顫、肌肉僵硬、運動遲緩及姿勢反射異?！?〕。長期以來，左旋多巴是治療PD的首選藥物〔2〕，但僅能對癥處理，且長期應(yīng)用有明顯的不良反應(yīng)，多數(shù)患者服藥3～5年后療效減退，產(chǎn)生癥狀波動、運動障礙、精神癥狀等不良反應(yīng)，使治療更加困難。因此，研究者一直在試圖尋找有效的神經(jīng)保護劑預(yù)防DA能神經(jīng)元變性，從而延緩PD的發(fā)生。Klotho蛋白與人類衰老密切相關(guān)〔3〕。該蛋白缺陷鼠可出現(xiàn)一系列與人類衰老相似的多種行為和病理變化：壽命縮短、運動失調(diào)、性功能障礙、

4、癡呆、白內(nèi)障、動脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松、肺氣腫和免疫功能降低等;基因敲除小鼠的步態(tài)異常，平均步長明顯縮短，類似人類PD患者的步態(tài);使用一定的方法使小鼠重新獲得基因，上述各種癥狀均能緩解〔4〕。1甲基4苯基1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)具有特異性的神經(jīng)毒性作用，能導(dǎo)致人類及多種動物出現(xiàn)PD癥狀〔5〕。本研究以對MPTP最敏感的C57BL/6小鼠為研究對象，用MPTP制備小鼠PD動物模型，觀察Klotho蛋白對MPTP導(dǎo)致的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷的影響，并對其機制進行了初步探討?！　?材料與方法　　1.1主要試劑與儀器酪氨酸羥化酶(TH)抗體購自美國Proto

5、sBiotech公司;MPTP購自美國Sigma公司;TH免疫組化試劑盒、DAB試劑購自美國VectorLaboratories公司;高效液相色譜儀為美國PTP的急性毒性反應(yīng)，觀察6d內(nèi)小鼠的行為學(xué)改變，包括反應(yīng)、自發(fā)活動、肌肉運動、運動障礙、異常行為等。　　1.3TH免疫組織化學(xué)染色　　1.3.1取材及冰凍切片于末次注射7d后將小鼠安樂死，然后斷頭取腦組織，置于含50mg/ml多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖固定液(PBS)中4℃固定6h，再置入含250g/L蔗糖的PBS溶液內(nèi)4℃過夜或至腦組織塊沉入瓶底。將腦組織塊于冠狀黑質(zhì)平面連續(xù)冰凍切片，片厚30μm。所切

6、連貫切片按序號保存于PBS液內(nèi)，每只鼠所得切片中隔5取1共取5張連貫切片進行TH免疫組織化學(xué)染色。各組切片選取部位盡量一致?！　?.3.2TH染色切片置入0.1mol/LPBS(pH7.4)沖洗3次每次10min;PBS+H2O2(2∶1)沖洗30min;0.1mol/LPBS沖洗3次每次10min;切片入滴加血清3滴的10mlPBS溶液中孵育30min;加一抗(1∶4000，用抗體稀釋液稀釋)，于濕盒內(nèi)4℃過夜;第2天PBS沖洗3次，每次10min;滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，孵育30min;PBS沖洗3次，每次10min;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液

7、，孵育1h;PBS沖洗3次，每次10min;Acetate緩沖液沖洗10min;DAB顯色4～5min;Acetate緩沖液沖洗10min，PBS沖洗3次，每次10min;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察并照相。因DAB顯色液中加入Nickel，陽性細胞為細胞質(zhì)和突起著藍色?！　?.3.3陽性細胞計數(shù)在每只鼠SNc連貫切片中隔5取1，共得5張切片，各組切片選取部位盡量一致。對照圖譜，應(yīng)用StereoInvestigator軟件在低倍視野下勾出SNc邊界〔4〕，設(shè)定計數(shù)范圍，高倍視野下計數(shù)選取框內(nèi)陽性細胞數(shù),順序為由左至右,自上而下,不完全位于視野