klotho蛋白對帕金森病模型小鼠的神經(jīng)保護作用論文

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1、Klotho蛋白對帕金森病模型小鼠的神經(jīng)保護作用論文【摘要】目的觀察Klotho蛋白對1甲基4苯基1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)所致C57BL/6小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護作用，并探討其可能的保護機制。方法C57BL/6小鼠分4組：野生型(PTP(PTP)組，Klotho蛋白高表達型(KO)生理鹽水對照組(KO+NS)，Klotho蛋白高表達型MPTP組(KO+MPTP)。PTP組和KO+MPTP組小鼠皮下注射MPTP(20mg/kg).freela公司;TH免疫組化試劑盒、DAB試劑購自美國VectorLaboratories公司;

2、高效液相色譜儀為美國PTP的急性毒性反應(yīng)，觀察6d內(nèi)小鼠的行為學(xué)改變，包括反應(yīng)、自發(fā)活動、肌肉運動、運動障礙、異常行為等。1.3TH免疫組織化學(xué)染色1.3.1取材及冰凍切片于末次注射7d后將小鼠安樂死，然后斷頭取腦組織，置于含50mg/ml多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖固定液(PBS)中4℃固定6h，再置入含250g/L蔗糖的PBS溶液內(nèi)4℃過夜或至腦組織塊沉入瓶底。將腦組織塊于冠狀黑質(zhì)平面連續(xù)冰凍切片，片厚30μm。所切連貫切片按序號保存于PBS液內(nèi)，每只鼠所得切片中隔5取1共取5張連貫切片進行TH免疫組織化學(xué)染色。各組切片選取部位盡量一致。1

3、.3.2TH染色切片置入0.1mol/LPBS(pH7.4)沖洗3次每次10min;PBS+H2O2(2∶1)沖洗30min;0.1mol/LPBS沖洗3次每次10min;切片入滴加血清3滴的10mlPBS溶液中孵育30min;加一抗(1∶4000，用抗體稀釋液稀釋)，于濕盒內(nèi)4℃過夜;第2天PBS沖洗3次，每次10min;滴加生物素標記的二抗工作液，孵育30min;PBS沖洗3次，每次10min;滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，孵育1h;PBS沖洗3次，每次10min;Acetate緩沖液沖洗10min;DAB顯色4～5min;Aceta

4、te緩沖液沖洗10min，PBS沖洗3次，每次10min;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察并照相。因DAB顯色液中加入Nickel，陽性細胞為細胞質(zhì)和突起著藍色。1.3.3陽性細胞計數(shù)在每只鼠SNc連貫切片中隔5取1，共得5張切片，各組切片選取部位盡量一致。對照圖譜，應(yīng)用StereoInvestigator軟件在低倍視野下勾出SNc邊界〔4〕，設(shè)定計數(shù)范圍，高倍視野下計數(shù)選取框內(nèi)陽性細胞數(shù),順序為由左至右,自上而下,不完全位于視野內(nèi)的細胞不計數(shù)。用StereoInvestigator軟件分析TH陽性細胞計數(shù)結(jié)果，每只鼠每張切片的細胞總

5、數(shù)和SNc的細胞總數(shù)由軟件統(tǒng)計。系統(tǒng)誤差由軟件統(tǒng)計，要求小于等于0.06。1.4紋狀體(Str)內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)含量的測定1.4.1組織樣品的制備及預(yù)處理各組小鼠斷頭取腦組織,于冰盒上分離并保留紋狀體組織,保存于-80℃冰箱備用。將組織樣品稱重，加入冰冷的樣品預(yù)處理A液100μl,冰浴中超聲勻漿10s,冰浴靜置1h，注意避光保存。4℃條件下，17000r/min離心7min〔5〕，取80μl上清液，加入40μl冰冷的預(yù)處理B液，渦旋混勻，冰浴靜置1h，4℃條件下，17000r/min離心7min，-80

6、℃冷凍保存待測。1.4.2上樣分析及繪制標準曲線設(shè)定樣品流量1.0ml/min，ECD設(shè)定電壓0.65V，每一樣品檢測35min。各標準品分別進樣，檢測其保留時間作為定性指標。DA、DOPAC、HVA的標準溶液最后用流動相倍比稀釋得6個濃度梯度:每20μl含16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5ng。分別進樣,檢測并繪制標準曲線。測定紋狀體DA、DOPAC、HVA的含量變化。1.5統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果以表示,應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。為了比較Klotho蛋白對MPTP誘致PD模型小鼠的神經(jīng)保護作

7、用，計算MPTP組和Ns對照組之間的損傷百分率。公式如下：損傷百分率=NS對照組MPTP組NS對照組×100%。2結(jié)果2.1各組小鼠行為學(xué)的變化PTP組小鼠在MPTP注射后數(shù)分鐘可出現(xiàn)陣發(fā)性軀干震顫、豎毛、豎尾、頻繁的竄蹦及爬桿不能等短暫的行為反應(yīng),隨后出現(xiàn)活動減少,但次日略見恢復(fù);KO+MPTP組上述表現(xiàn)不明顯。PTP組與KO+MPTP組均出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、步態(tài)不穩(wěn)、自發(fā)活動減少等行為學(xué)改變。2.2各組小鼠SNc內(nèi)TH免疫組化染色結(jié)果PTP組黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元減少，TH陽性纖維和胞體稀疏，TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少，陽性染色較弱。鏡下可見殘留神經(jīng)元

8、皺縮，突起減少或消失(圖1)。KO+NS組小鼠黑質(zhì)致密部可見TH陽性神經(jīng)元和纖維，細胞較大，多為橢圓形，胞漿