資源描述：
《rhoc-sirna表達載體的構建及其對肝癌細胞體外侵襲能力的影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、RhoC?siRNA表達載體的構建及其對肝癌細胞體外侵襲能力的影響鄭文建梁平趙弘智韓克強【摘要】目的構建RhoC?siRNA表達載體，研究其對肝癌細胞體外侵襲潛能的影響。方法以脂質體轉染法穩(wěn)定轉染人SK?Hep1肝癌細胞株，ethodsRhoC?siRNAgeneigration,andcellinvasionbeforeandaftertransfectionedigestionandDNAsequencingconfirmedthattheRhoCspecificsiRNAexpressionvectorigration,andcellinvasionarke
2、dly,etastasis,ayprovideanovelapplicablestrategyforgenetherapyofHCC.【Keyors;Invasion;RhoC?siRNARho(rashomologous)基因亞家族成員(RhoA、B、C)是一類與ras同源的小GTP結合蛋白，Rho亞家族蛋白的異常表達可能與惡性腫瘤的侵襲、轉移有關。有資料表明，RhoC基因產(chǎn)物的過量表達與肝癌發(fā)展及侵襲、轉移有密切關系［1］。本研究通過構建RhoC特異性siRNA真核表達載體，并穩(wěn)定轉染到肝癌細胞株SK?Hep1中，以探討抑制RhoC蛋白表達對肝癌細胞侵襲轉移能
3、力的影響。1材料與方法1.1材料1.1.1細胞株、菌株及質粒：人肝癌細胞株SK?Hep1購自中科院上海細胞所，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由新橋醫(yī)院中心實驗室保存，質粒pSilencer2.1為Ambion公司產(chǎn)品。1.1.2酶和試劑：新生牛血清購自PAA，RPMI1640購自Hyclone，G418購自BPI，DOTAP購自Roche，羊抗人RhoC多克隆抗體購自SantaCruz，HRP標記的兔抗羊二抗購自北京中杉公司，質粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自中鼎公司，T4DNALigase、BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、λ?EcoT14ⅠMarker購
4、自TaKaRa。其他試劑均為分析純。1.1.3模板DNA：插入雙鏈寡核苷酸基因片段(BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+終止信號+SalⅠ+HindⅢ)，A：5′?GATCCGGATCAGTTTCCGGAGGTCTTCAAGACGGACCTCCGGAAACTGATCCTTTTT?TGTCGACA?3′，B：3′?GCCTAGTCAAAGGCCTCCA?GAAGTTCTGCCTGGAGGCCTTTGACTAGGAAAAAA?CAGC?TGTTCGA?5′，由武漢晶賽生物公司合成。其編碼的siRNA為AAGGATCAGTTTCCGGAGGTC，該序列
5、經(jīng)Blast查詢與人類其他基因無同源性。通用陰性對照質粒pSilencer2.1?HK為武漢晶賽生物公司產(chǎn)品。其編碼的siRNA為ACTACCGTTGTTATAGGTG，該序列經(jīng)過Blast比較，與人、鼠基因庫無明顯同源。1.2方法1.2.1pSilencer2.1真核表達載體的構建及鑒定：按基因克隆方法構建重組質粒pSilencer2.1?RhoC?siRNA，經(jīng)擴增并提取質粒后，用SalⅠ做酶切鑒定，并送上海英駿公司進行DNA全長自動測序。1.2.2重組體轉染SK?Hep1細胞及轉染后細胞中RhoC表達的檢測：分別用pSilencer2.1?RhoC?siRN
6、A和pSilencer2.1?HK轉染SK?Hep1細胞，48h后稀釋傳代并在培養(yǎng)基中加入G418(300μg/ml)篩選培養(yǎng)2周左右，將抗性細胞克隆轉至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)并傳代建系，分別命名為SK?Hep1/RhoC?siRNA和SK?Hep1/HK細胞。收集細胞，用RIPA液裂解，離心取上清液行atrigel(1mg/ml)的24孔板中常規(guī)培養(yǎng)：(1)1h后按MTT比色法測各孔細胞的OD570值，并計算黏附率(黏附率=黏附細胞OD570值/總細胞OD570值×100%)；(2)細胞基本長滿后劃痕，以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后觀察細胞向劃痕區(qū)的遷移能力。(責任編輯：)1
7、.2.4細胞侵襲分析：Boyden小室法［2］。培養(yǎng)16h后計數(shù)PET膜下表面5個400倍顯微視野中的細胞數(shù)，以侵襲細胞的相對數(shù)目反映細胞的侵襲能力。每組平行設3個小室。1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，對不同的數(shù)據(jù)資料分別采用t檢驗及χ2檢驗。2結果2.1pSilencer2.1真核表達載體的構建與鑒定2.1.1重組載體的酶切鑒定：將pSilencer2.1、pSilencer2.1?HK及重組的pSilencer2.1?RhoC?siRNA質粒分別進行SalⅠ酶切電泳(圖1)。質粒pSilence2.1的序列里沒有SalⅠ的酶切位點，不能被
8、SalⅠ所
