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1、清熱祛濕益氣法對(duì)ConA誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的超微病理研究論文劉超黃霞，孫為，劉惠霞【摘要】目的觀察清熱祛濕益氣法(QSYF)對(duì)ConA誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的影響。方法Balb/c雄性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，QSYF低、中、高劑量組，予雙蒸水(空白對(duì)照組、模型對(duì)照組)或QSYF藥劑(QSYF不同劑量組)，連續(xù)灌胃7d，空白對(duì)照組注射等量無菌PBS溶液.freela公司產(chǎn)品，批號(hào)C2010。實(shí)驗(yàn)時(shí)用無菌PBS溶液配成2mg/ml的溶液備用;戊二醛，上海國(guó)云集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20040420。1.2受試藥物清熱祛濕益氣法(簡(jiǎn)稱QSYF)中藥由虎杖、連翹、板藍(lán)根、黃
2、芪、西洋參、山藥、五味子、甘草組成，經(jīng)提取濃縮為藥物浸膏液，每毫升含原生藥2g，河南省中醫(yī)藥研究院中藥分析室提供，批號(hào)20060506。1.3動(dòng)物與分組Balb/c雄性小鼠23～28g,.freell/20g，QSYF低、中、高劑量組分別給予QSYF藥液5，10，15g/kg，各組連續(xù)灌胃7d。第7天動(dòng)物禁食14h后，除空白對(duì)照組外，各組小鼠尾靜脈注射ConA溶液20mg/kg，空白對(duì)照組小鼠注射等體積無菌PBS溶液，于注射后6h處死小鼠，立即解剖肝臟，同部位剪取肝組織，做以下處理：將肝組織在蠟板上迅速切成0.5mm3的肝組織小塊，放入預(yù)冷的4%戊二醛PBS溶液中固定，鋨酸后固定，常規(guī)制作
3、超薄切片，進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察。3結(jié)果3.1QSYF對(duì)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響空白對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，核呈卵圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，線粒體嵴排列整齊，含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見脫顆粒現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)未出現(xiàn)異常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。見圖1(a，b)。模型組肝細(xì)胞形態(tài)多邊形，肝細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)許多細(xì)小脂滴;線粒體腫脹，數(shù)目明顯減少，線粒體嵴變短或模糊消失，嵴內(nèi)腔增大呈泡狀;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也明顯減少并呈泡狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核可見出芽狀態(tài)，異染色質(zhì)電子密度增高，核仁電子密度也增高。見圖1(c，d)。SYF低、中、高劑量組與模型組比較，隨劑量增大肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴減少，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，中、高劑量組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴大部分
4、排列整齊，細(xì)胞核異染色質(zhì)明顯減少，而常染色質(zhì)明顯增多;高劑量肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多并呈多層狀排列。各劑量組均未有細(xì)胞核出芽現(xiàn)象。見圖1(e,f,g,h,i,j)。圖1各組小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)病理圖片比較3.2QSYF各組肝細(xì)胞立體計(jì)量學(xué)定量觀測(cè)結(jié)果每組動(dòng)物隨機(jī)取兩只動(dòng)物肝組織，各肝組織隨機(jī)切3張切片。每張切片隨機(jī)拍5張照片，共計(jì)30張/組，進(jìn)行立體計(jì)量學(xué)測(cè)定肝細(xì)胞線粒體的體密度(Vv)、比表面(δ)、比膜面(δm)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比膜面及核染質(zhì)常異染色質(zhì)的體密度(Vv)、核比表面測(cè)量。結(jié)果顯示，模型組與空白組比較線粒體Vv、線粒體δ、線粒體δm、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)δm、核比表面測(cè)量值均顯著降低，QSYF中、高劑量
5、組與模型組比較上述指標(biāo)均明顯升高，差異均有顯著性意義(P0.05)。見表1～2。表1各組肝細(xì)胞線粒體體密度、比表面、比膜面及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比膜面測(cè)得結(jié)果表2各組肝細(xì)胞細(xì)胞核異染色質(zhì)、常染色質(zhì)及核比表面的測(cè)量結(jié)4討論我們采用ConA復(fù)制肝損傷小鼠模型，小鼠血清ALT，TBIL在注射后6h達(dá)到峰值，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致3。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)各組肝組織超微結(jié)構(gòu)的觀察分析顯示，模型組肝細(xì)胞的損傷主要表現(xiàn)有肝細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)小脂滴，說明部分肝細(xì)胞出現(xiàn)脂代謝障礙。其機(jī)理分析為肝細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到嚴(yán)重的損傷，造成能量代謝障礙，ATP生成減少，同時(shí)蛋白質(zhì)代謝也發(fā)生障礙;主要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯減少且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)出現(xiàn)泡狀結(jié)構(gòu)的改變。從立體計(jì)
6、量學(xué)測(cè)得的結(jié)果可以看出，線粒體的Vv明顯減小，說明細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目減少，線粒體的δ縮小說明線粒體體積增大,而線粒體的比膜面明顯減少，提示線粒體體積增大是水腫造成的，而線粒體嵴縮短模糊或消失，嵴間腔擴(kuò)大，因此比膜面減少而功能降低，生成ATP障礙。研究表明，模型組肝細(xì)胞的損傷主要嚴(yán)重影響細(xì)胞的能量代謝和蛋白質(zhì)代謝，而對(duì)核酸的代謝影響不大,從核表面出現(xiàn)發(fā)芽的現(xiàn)象并有異染色質(zhì)電子密度增高所提示，ConA性肝損傷的發(fā)生機(jī)制與肝細(xì)胞凋亡有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符4，5。QSYF各組在核形態(tài)結(jié)構(gòu)上均未發(fā)現(xiàn)有核出芽現(xiàn)象和異染色質(zhì)電子密度增高的現(xiàn)象，提示QSYF對(duì)ConA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡具有拮抗作用,并隨著劑量的
7、增加肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴逐漸減少，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，研究結(jié)果表明QSYF通過增強(qiáng)線粒體的數(shù)目和功能、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的代謝，發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用，減輕肝損傷，其量效關(guān)系呈正相關(guān)。【
