清熱祛濕益氣法對ConA誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的超微病理研究

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1、清熱祛濕益氣法對ConA誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的超微病理研究作者：劉超黃霞，孫為，劉惠霞【摘要】目的觀察清熱祛濕益氣法(QSYF)對ConA誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的影響。方法Balb/c雄性小鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型對照組，QSYF低、中、高劑量組，予雙蒸水(空白對照組、模型對照組)或QSYF藥劑(QSYF不同劑量組)，連續(xù)灌胃7d，空白對照組注射等量無菌PBS溶液，其他組靜脈注射ConA復(fù)制肝損傷模型，6h后立即解剖肝臟，同部位取肝組織，進(jìn)行電鏡觀察。結(jié)果模型對照組肝細(xì)胞出現(xiàn)許多細(xì)小脂滴,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體數(shù)目明顯減少，

2、線粒體腫脹，嵴模糊。核表面發(fā)芽現(xiàn)象并異染色質(zhì)電子密度增高。QSYF各組均無核表面發(fā)芽等現(xiàn)象，且隨QSYF藥液劑量增大上述病變明顯減輕。結(jié)論QSYF對ConA誘導(dǎo)的肝損傷具有明顯的拮抗作用。【關(guān)鍵詞】清熱祛濕益氣法;刀豆蛋白A;肝損傷;超微病理;小鼠清熱祛濕益氣法是中醫(yī)臨床治療肝病的有效治則，多年來治療乙肝、甲肝等肝臟疾病療效顯著。肝病的發(fā)病機(jī)制與T細(xì)胞功能紊亂密切相關(guān)[1]，而刀豆蛋白A(Con6A)可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生T細(xì)胞依賴性急性肝損傷[2]，我們進(jìn)行了清熱祛濕益氣法對該模型動物超微病理實驗研究，以探討清熱祛濕益氣法的作用

3、機(jī)理?，F(xiàn)報道如下。　　1材料　　1.1試劑刀豆蛋白A(ConA)，美國Sigma公司產(chǎn)品，批號C2010。實驗時用無菌PBS溶液配成2mg/ml的溶液備用;戊二醛，上海國云集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號20040420。　　1.2受試藥物清熱祛濕益氣法(簡稱QSYF)中藥由虎杖、連翹、板藍(lán)根、黃芪、西洋參、山藥、五味子、甘草組成，經(jīng)提取濃縮為藥物浸膏液，每毫升含原生藥2g，河南省中醫(yī)藥研究院中藥分析室提供，批號20060506?！　?.3動物與分組Balb/c雄性小鼠23～28g,河南省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK

4、(豫)2005-001?！　?方法　　動物隨機(jī)分為5組?？瞻讓φ战M和模型對照組分別給予雙蒸水0.4ml/20g，QSYF低、中、高劑量組分別給予QSYF藥液5，10，15g/kg，各組連續(xù)灌胃7d。第7天動物禁食14h后，除空白對照組外，各組小鼠尾靜脈注射ConA溶液206mg/kg，空白對照組小鼠注射等體積無菌PBS溶液，于注射后6h處死小鼠，立即解剖肝臟，同部位剪取肝組織，做以下處理：將肝組織在蠟板上迅速切成0.5mm3的肝組織小塊，放入預(yù)冷的4%戊二醛PBS溶液中固定，鋨酸后固定，常規(guī)制作超薄切片，進(jìn)行透射電子顯微鏡

5、觀察?！　?結(jié)果　　3.1QSYF對肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響空白對照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，核呈卵圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，線粒體嵴排列整齊，含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見脫顆粒現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)未出現(xiàn)異常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。見圖1(a，b)。模型組肝細(xì)胞形態(tài)多邊形，肝細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)許多細(xì)小脂滴;線粒體腫脹，數(shù)目明顯減少，線粒體嵴變短或模糊消失，嵴內(nèi)腔增大呈泡狀;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也明顯減少并呈泡狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核可見出芽狀態(tài)，異染色質(zhì)電子密度增高，核仁電子密度也增高。見圖1(c，d)。SYF低、中、高劑量組與模型組比較，隨劑量增大肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴減少，線粒體

6、、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，中、高劑量組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴大部分排列整齊，細(xì)胞核異染色質(zhì)明顯減少，而常染色質(zhì)明顯增多;高劑量肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多并呈多層狀排列。各劑量組均未有細(xì)胞核出芽現(xiàn)象。見圖1(e,f,g,h,i,j)?！　D1各組小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)病理圖片比較　　3.62QSYF各組肝細(xì)胞立體計量學(xué)定量觀測結(jié)果每組動物隨機(jī)取兩只動物肝組織，各肝組織隨機(jī)切3張切片。每張切片隨機(jī)拍5張照片，共計30張/組，進(jìn)行立體計量學(xué)測定肝細(xì)胞線粒體的體密度(Vv)、比表面(δ)、比膜面(δm)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比膜面及核染質(zhì)常異染色質(zhì)的體密度(Vv)、核比表

7、面測量。結(jié)果顯示，模型組與空白組比較線粒體Vv、線粒體δ、線粒體δm、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)δm、核比表面測量值均顯著降低，QSYF中、高劑量組與模型組比較上述指標(biāo)均明顯升高，差異均有顯著性意義(P<0.05)。見表1～2。表1各組肝細(xì)胞線粒體體密度、比表面、比膜面及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比膜面測得結(jié)果表2各組肝細(xì)胞細(xì)胞核異染色質(zhì)、常染色質(zhì)及核比表面的測量結(jié)　　4討論　　我們采用ConA復(fù)制肝損傷小鼠模型，小鼠血清ALT，TBIL在注射后6h達(dá)到峰值，與文獻(xiàn)報道基本一致[3]。通過對實驗各組肝組織超微結(jié)構(gòu)的觀察分析顯示，模型組肝細(xì)胞的損傷主要表現(xiàn)有

8、肝細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)小脂滴，說明部分肝細(xì)胞出現(xiàn)脂代謝障礙。其機(jī)理分析為肝細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到嚴(yán)重的損傷，造成能量代謝障礙，ATP生成減少，同時蛋白質(zhì)代謝也發(fā)生障礙;主要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯減少且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)出現(xiàn)泡狀結(jié)構(gòu)的改變。從立體計量學(xué)測得的結(jié)果可以看出，線粒體的Vv明顯減小，說明細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目減少，線粒體的δ6縮小說