柴胡疏肝散抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

《柴胡疏肝散抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究 》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。

1、柴胡疏肝散抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究付德才楊世忠宋祥福【摘要】目的探討柴胡疏肝散對(duì)肝纖維化大鼠模型αSMA、TGFβ1的影響及其抗纖維化的機(jī)制。方法采用40%CCl4皮下注射，制備肝纖維化模型并以柴胡疏肝散干預(yù)，測(cè)定肝功能、血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)及肝組織羥脯氨酸(HYP)，光鏡觀察肝組織病理變化，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織αSMA、TGFβ1表達(dá)，RTPCR檢測(cè)TGFβ1mRNA的表達(dá)。結(jié)果柴胡疏肝散組較模型組:肝功能明顯改善，血清HA及LN顯著降低，肝組織HYP含量明顯少，肝組織纖維化程度明顯改善，肝組織αSMA及TGFβ1表

2、達(dá)減少。結(jié)論柴胡疏肝散對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有良好的防治作用?！娟P(guān)鍵詞】柴胡疏肝散；肝纖維化；αSMA；TGFβ1　　近年來柴胡疏肝散抗肝纖維化的臨床研究取得了較好的臨床效果〔1〕，但目前國(guó)內(nèi)外尚無柴胡疏肝散抗肝纖維化的基礎(chǔ)研究。本實(shí)驗(yàn)采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纖維化模型,觀察柴胡疏肝散的抗肝纖維化作用,并探討其對(duì)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFβ1)影響及柴胡疏肝散抗肝纖維化的理論機(jī)制?！　?材料與方法　　11材料　　111動(dòng)物及藥物雄性22月齡A試劑盒購(gòu)自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體購(gòu)自武

3、漢博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新試劑公司，DAB購(gòu)自北京中山生物公司，RTPCR兩步法試劑盒購(gòu)自TAKARA公司，Trizol購(gòu)自Sangon公司?！　?2方法　　121模型制作參照文獻(xiàn)〔2〕方法：實(shí)驗(yàn)第1天除正?？瞻讓?duì)照組(對(duì)照組)外,其余動(dòng)物皮下注射CCl4分析純05ml/100g(體重),以后每隔3d注射40%CCl4橄欖油劑03ml/100g(體重),連續(xù)8g/(kg·d)-1，共8l，制備成100g/L肝組織勻漿，4000r/min4℃離心，取上清液保存于-20℃。肝右葉置于40g/L中性甲醛液中常規(guī)固

4、定后，石蠟包埋，用于制作組織芯片?！　?3檢測(cè)指標(biāo)　　131血清及組織纖維化指標(biāo)檢測(cè)測(cè)定血清肝功能包括總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/G，檢測(cè)透明質(zhì)酸(HA)，Ⅲ型前膠原(PCⅢ)，N型膠原()，層黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝勻漿檢測(cè)羥脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，均按試劑盒說明書操作?！　?32病理檢測(cè)組織芯片分別行常規(guī)HE染色，Masson三色染色(染膠原纖維)及網(wǎng)織纖維染色，光鏡下觀察，并根據(jù)王泰齡等改進(jìn)的肝纖維化半定量評(píng)分系統(tǒng)(SSS)

5、〔3〕進(jìn)行炎癥活動(dòng)度及肝纖維化程度計(jì)分?！　?33免疫組織化學(xué)檢查αSMA、TGFβ1采用石蠟包埋常規(guī)切片,SP法,兔抗鼠TGFβ1,多克隆抗體及鼠抗鼠αSMA單克隆抗體均以1∶100稀釋,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性組織呈棕色，陰性組織呈藍(lán)色在全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)上，采用HPIAS2000型圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，隨機(jī)選取每張切片10個(gè)視野(×400)倍測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的A值與所占視野面積，取其乘積平均值為該組織切片所得值，兩項(xiàng)乘積越大表明組織中該抗原含量越高?！　?34RTPCR檢測(cè)大鼠GAPDH上游引物

6、:5＇CATGACCACAGTCCATGCCATC3＇,下游引物：5＇CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC3＇全長(zhǎng)450bp；TGFβ1上游引物：5＇TGAGTGGCTGTCTTTTGACG3＇，下游引物：5＇ACTTCCAACCCAGGTCCTTC3＇全長(zhǎng)350bp。αSMA上游引物：5＇AAGAGGAAGACAGCACAGCTC3＇,下游引物：5＇GATGGATGGGAAAACAGCC3＇稱取50～100mg肝組織用Trizol提取總RNA，采用分光光度法測(cè)定其含量及純度，測(cè)定A260/A280值。取2μg總RN

7、A，42℃逆轉(zhuǎn)錄90min。參數(shù)設(shè)置94℃變性,3min×1循環(huán)。94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)。最后72℃徹底延伸7min×1循環(huán)。同法擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參照。取5μlPCR產(chǎn)物15%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)灰度,TGFβ1/GAPDH比值表示TGFβ1mRNA相對(duì)水平。αSMA/GAPDH比值表示αSMAmR2NA相對(duì)水平?！　?4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，經(jīng)SPSS1110軟件包進(jìn)行方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)?！　?結(jié)果　　21各組大鼠肝功能改變模型組ALT、AST顯

8、著升高,ALB顯著降低；干預(yù)組ALT、AST較模型組明顯降低,ALB則顯著升高。