整合素β1在小鼠慢性心肌炎中的作用論文

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1、整合素β1在小鼠慢性心肌炎中的作用論文吳輝唐其柱葉明丁家望李書國李莉李松李穩(wěn)慧陳勇楊俊【摘要】目的觀察整合素β1(CD29)在慢性心肌炎小鼠心肌的表達(dá)，探討其在慢性心肌炎中的作用。方法豬心肌肌凝蛋白致Balb/c小鼠自身免疫性心肌炎模型，觀察并記錄免疫小鼠發(fā)病情況，同時用免疫組化SP法檢測CD29在心肌的表達(dá)變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)早期(初次免疫后14、30d)，小鼠心肌淋巴細(xì)胞浸潤較明顯，CD29在心肌的表達(dá)高于正常組(P0.05);實(shí)驗(yàn)后期(60、120d)，小鼠心肌炎癥細(xì)胞減少，而心臟重量與體重的比值增加顯著.freelol/L磷酸鉀緩沖液中，終濃度1.

2、0mg/ml,然后與等體積完全弗氏佐劑(Sigma公司)混合研磨成乳濁液，在實(shí)驗(yàn)組小鼠雙側(cè)腹股溝、腋部皮下及足墊皮下注射，每只小鼠注射肌凝蛋白量為1mg。對照組僅用等量的0.14mol/L磷酸鉀緩沖液與等體積完全弗氏佐劑混合液在相同位置注射。免疫時間為第1、7、30天。分別在初次免疫后第14、30、60和120天處死小鼠前，稱取小鼠的體重及心臟重量，并計(jì)算二者比值。1.3病理檢查心臟離體后，以10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，部分做常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察，余下切片待做免疫組織化學(xué)檢測。1.4免疫組化SP法將石蠟切片脫蠟及抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PB

3、S)沖洗后，加3ml/L過氧化氫處理10min;再以PBS沖洗后，依次滴加正常羊血清(室溫30min)，大鼠抗小鼠單克隆抗體(Biolegend公司)(1∶200)(37℃孵育60min,PBS洗)，生物素標(biāo)記的兔抗大鼠IgG(中山公司)(1∶40，37℃孵育30min，PBS洗)，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素襯染，然后常規(guī)脫水、透明、封片，鏡檢觀察結(jié)果，呈棕黃色者判為陽性。采用HPIAS2000型圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)陽性率。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2.1小鼠心臟重量與

4、體重比值與對照組比較，初次免疫后14d實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟重量與體重比值無顯著變化(P0.05);而在免疫30d后，實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟重量與體重比值明顯增加(P0.05)，見表1。表1兩組小鼠不同時間點(diǎn)心重/體重比較與對照組比較：1)P0.05，下表同2.2病理檢查結(jié)果初次免疫后第14～30天，心肌炎性細(xì)胞浸潤明顯，心肌細(xì)胞間質(zhì)可見到局灶性的炎性細(xì)胞浸潤，主要為淋巴細(xì)胞，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好。第60～120天，炎癥細(xì)胞減少，纖維化開始出現(xiàn)。對照組中均未見到上述改變(圖1)。2.3CD29表達(dá)變化隨著病程進(jìn)展，CD29在心肌的表達(dá)逐漸增多(圖2);與對照組相比，在初

5、次免疫30d以后，實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌CD29的表達(dá)顯著增加(P0.05)，見表2。表2兩組小鼠CD29在心肌的表達(dá)比較3討論本實(shí)驗(yàn)中，來自于異體(豬)的肌凝蛋白與小鼠自身抗原心肌凝蛋白結(jié)構(gòu)相似，它可激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞而誘發(fā)小鼠自身免疫性心肌炎，即是近年來提出的分子模擬理論〔1〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)用抗體阻止CD29的作用，則能夠阻止遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生，這包括移植物對宿主疾病、抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、半抗原誘導(dǎo)的結(jié)腸炎等〔3～6〕。本實(shí)驗(yàn)中，慢性心肌炎小鼠心肌CD29的表達(dá)隨著心肌炎癥及纖維化的進(jìn)展而逐漸升高，其機(jī)制可能在于：①為炎癥細(xì)胞的募集和保留

6、提供了一種黏附環(huán)境〔7〕;②在以后的過程中作為層黏蛋白、纖維素連接蛋白和玻連蛋白的受體參與對心肌細(xì)胞的固定〔8〕;③像急性心肌炎中高度表達(dá)的細(xì)胞間黏附分子一樣〔9〕，調(diào)節(jié)釋放毒素的免疫效應(yīng)細(xì)胞黏附到表達(dá)CD29的心肌細(xì)胞。在整合素家族中，CD29還獨(dú)特表達(dá)于心肌〔10〕，它可作為心肌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相互作用的黏附受體，使細(xì)胞得以附著ECM形成整體，介導(dǎo)細(xì)胞察覺環(huán)境變化并做出反應(yīng)或改變環(huán)境的能力。本實(shí)驗(yàn)建立的是一種持續(xù)刺激模型，至初次免疫后第120天，小鼠心臟增大，心肌纖維化明顯，與此同時，心肌細(xì)胞所表達(dá)的CD29也不斷增加,這可解釋為心肌不

7、斷地對環(huán)境變化作出的反應(yīng)。CD29是心肌細(xì)胞表面信號協(xié)同受體，并能調(diào)節(jié)傳統(tǒng)受體的信號通路，包括生長因子受體、耦聯(lián)G蛋白受體。在CD29激活的過程中，多種蛋白在病灶黏附帶聚集形成一個由CD29調(diào)節(jié)的信號傳導(dǎo)復(fù)合物黏著斑激酶(FAK),FAK是細(xì)胞活動的調(diào)節(jié)物，體內(nèi)FAK缺乏時細(xì)胞活動性降低，F(xiàn)AK表達(dá)增高時細(xì)胞活動性增強(qiáng)。FAK磷酸化活性改變隨CD29密度增加而增加。Schaller〔11〕證實(shí)CD29與特定的ECM結(jié)合后在病灶所產(chǎn)生的信號有助于細(xì)胞的生長、存活。Ding〔12〕等通過對主動脈狹窄的動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在從細(xì)胞肥大到心衰的發(fā)展過程中細(xì)胞凋亡

8、和細(xì)胞表面CD29與ECM橋接的瓦解有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，心肌細(xì)胞受外周環(huán)境的影響，CD29的表達(dá)代償性增高。初次