增齡對大鼠海馬nshc蛋白的影響

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1、增齡對大鼠海馬NShc蛋白的影響作者：胡長春葉露夢朱婉兒【摘要】目的研究不同月齡大鼠海馬NShc蛋白的表達(dá)，以及經(jīng)氧化應(yīng)激后NShc磷酸化水平的改變隨年齡的增加而變化的規(guī)律。方法采用蛋白免疫印跡的方法，分別分析幼年組、成年組和老年組大鼠海馬NShc蛋白的表達(dá)水平，以及經(jīng)H2O2刺激后NShc磷酸化水平的改變。結(jié)果幼年組、成年組、老年組海馬NShc蛋白的含量依次減少（P＜0.05），但成年組和老年組之間沒有顯著性差異；H2O2處理后，幼年組、成年組、老年組海馬NShc蛋白磷酸化水平也依次減少（P＜0.01），而成年組和老年組之間無顯著差異。結(jié)論隨著年齡的增加，海馬中NShc蛋白

2、的表達(dá)逐漸減少并且NShc蛋白的活性逐漸降低?！娟P(guān)鍵詞】增齡；NShc；海馬；氧化應(yīng)激增齡作為細(xì)胞的應(yīng)激刺激，會引起一系列細(xì)胞內(nèi)蛋白含量和功能的改變〔1〕。研究證明，細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在機(jī)體衰老過程中起著重要作用〔2〕。NShc蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的Shc銜接蛋白家族的一員〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，在生理?xiàng)l件下NShc能增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激作用，抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命〔4〕。但NShc蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和功能是否受增齡的影響尚不清楚。本研究將大鼠海馬NShc蛋白的表達(dá)以及氧化應(yīng)激后NShc磷酸化水平的改變作為觀察指標(biāo)，通過觀察其在不同月齡大鼠中的變化規(guī)律，探討增齡對大鼠海馬N

3、Shc蛋白含量和功能的影響。1材料與方法1.1動物與分組雄性SD大鼠，購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。適應(yīng)期7d，自由攝食和飲水，室溫24℃，光/暗周期分別為12h(光照時間08:00～20:00)。其中分別取3、6、18個月齡大鼠為幼年組、成年組和老年組，每組5只。1.2試劑羊多克隆NShc抗體購于SantaCruz公司；鼠單克隆抗NShc抗體、抗Shc抗體、抗Sck抗體購于Transduction實(shí)驗(yàn)室；抗磷酸酪氨酸(pTyr)單克隆抗體4G10購于UpstateBiotechnologyInc；其他相關(guān)試劑均購于Sigma公司。1.3方法1.3.1蛋白提取和定量大鼠在麻醉

4、后斷頭，并在冰上分離出海馬、嗅球、額皮質(zhì)、后皮質(zhì)、丘腦、下丘腦、小腦、脊髓、心臟、肝臟、肌肉組織。在冰浴中將組織標(biāo)本置于1ml裂解液中超聲處理30s，14000r/min離心30s，取上清夜到0.5ml離心管中，于-20℃保存。然后采用Bradford比色法進(jìn)行蛋白定量。1.3.2H2O2處理的海馬組織分離和切片制作大鼠在無麻醉狀態(tài)下斷頭，在冰上分離出海馬，隨后用McIl的切片；37℃條件下，切片在含氧的KR緩沖液中培養(yǎng)1h，恢復(fù)生理活性；每一月齡組的每只大鼠海馬切片分為4組：對照組只是培養(yǎng)在KR緩沖液中，其余3組分別在含有1mmol/LH2O2的KR緩沖液中處理5、15和30min。1.3

5、.3免疫沉降取含有500μg蛋白的大鼠海馬組織蛋白上清液，在冰上加適量羊多克隆NShc抗體反應(yīng)1h，隨后與G蛋白瓊脂混合，放在振動平臺上反應(yīng)一個晚上；次日以14000r/min離心30s，棄去上清夜，沉淀物用PBS清洗兩次，加入50μl1/3SDS2巰基乙醇上樣緩沖液，于沸水中加熱5min，然后放入冰中冷卻5min后，取14000r/min離心，取上清夜作為電泳樣品進(jìn)行免疫印跡分析。1.3.4免疫印跡分析依照標(biāo)準(zhǔn)方法提取的蛋白，進(jìn)行SDSPAGE電泳；然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用封閉液A（含5％脫脂奶粉的TTBS緩沖液，針對非磷酸化抗體）或封閉液B（含5％BAS的TBST緩沖液

6、，針對磷酸化抗體）封閉1h；按推薦濃度的第一抗體（鼠抗NShc抗體、鼠抗Sck抗體、鼠抗Shc抗體或抗pTyr抗體）室溫下反應(yīng)2h，用TTBS200ml清洗3次；按推薦二抗(抗鼠IgGHRP)的濃度室溫孵育1h，然后同上清洗；最后加入發(fā)光底物后X光膠片感光30min，經(jīng)顯影定影顯現(xiàn)信號。1.3.5圖象分析X光膠片經(jīng)GS800Calibrated圖像光密度儀分析，測定目標(biāo)帶單位密度，并以正常對照的單位密度值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正，定量分析磷酸化NShc蛋白和總NShc蛋白水平。磷酸化NShc蛋白量和總NShc蛋白量相除可得各個樣本的磷酸化程度，所得數(shù)據(jù)除以相應(yīng)月齡對照組（H2O2刺

7、激0min）的平均值作為NShc磷酸化含量。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以x±s表示，SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1Shc家族蛋白在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)及其他系統(tǒng)組織的表達(dá)大鼠NShc蛋白（包括p52NShc和p64NShc）和Sck蛋白的表達(dá)集中在神經(jīng)系統(tǒng)各組織（包括嗅球、額皮質(zhì)、后皮質(zhì)、海馬、丘腦、下丘腦、小腦和脊髓），在心臟、肝臟和肌肉組織中幾乎沒有表達(dá)