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1、-------上海交通大學碩士分析生學位論文乳鐵蛋白的仿生親和純化分析摘要人乳鐵蛋白是一種分子質(zhì)量為70～80kD的糖蛋白，屬轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員，具有廣譜抗菌，抗病毒，抗腫瘤，調(diào)節(jié)機體免疫反應等多種生物活性，在功能營養(yǎng)食品和醫(yī)療保健等方面具有廣闊的應用前景。過去，因人乳鐵蛋白來源有限，嚴重限制了其商業(yè)開發(fā)。隨著動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，中國農(nóng)業(yè)大學李寧教授分析團隊構(gòu)建了牛乳腺生物反應器，在牛乳腺中高量表達重組人乳鐵蛋白，牛乳中人乳鐵蛋白濃度達2.529±0.212mg/mL～3.429±0.417mg/mL，有可能實現(xiàn)
2、重組人乳鐵蛋白在牛乳腺中的規(guī)模生產(chǎn)。本課題分析目的是針對乳鐵蛋白分析開發(fā)仿生親和配體，仿生親和分離材料以及建立從轉(zhuǎn)基因牛乳中大規(guī)模純化重組人乳鐵蛋白的工藝。本分析首先設(shè)計合成了一個仿生親和分離材料庫，含322中不同結(jié)構(gòu)的配體；利用篩選方法得到了特異性結(jié)合重組人乳鐵蛋白的β-丙氨酸親和配體，其結(jié)構(gòu)為β-丙氨酸經(jīng)三氯三嗪間隔臂共價偶聯(lián)于氨基活化的Sepharose-6B上。通過對固定化β-丙氨酸純化重組人乳鐵蛋白的pH和離子強度條件進行優(yōu)化，確定介質(zhì)對重組人乳鐵蛋白的最佳結(jié)合條件為：50mMTris-HCl/0.1M
3、NaCl,pH7.0；最佳洗脫條件為：0.1MGly-HCl,pH2.4。純化得到的重組人乳鐵蛋白純度>95%，回收率達81.6%，固定化β-丙氨酸對重組人乳鐵蛋白的最大吸附量達65.6mg/g干介質(zhì)，并且能夠耐受NaOH溶液的清洗與再生。經(jīng)MALDI-TOF鑒定，所純化的蛋白即為重組人乳鐵蛋白。N端測序結(jié)果表明，重組人乳鐵蛋白N端氨基酸序列為GRRRRSVQW，與天然人乳鐵蛋白相同。------------I------------上海交通大學碩士分析生學位論文對重組人乳鐵蛋白最重要的兩個生物學活性進行了鑒定。
4、在體外經(jīng)鐵溶液處理后，重組與天然人乳鐵蛋白均能結(jié)合鐵離子，而且這種鐵結(jié)合能力與環(huán)境中的pH直接相關(guān)。當pH降至4.5時，鐵離子開始從蛋白中釋放出來。在pH2.0時，蛋白幾乎全部釋放掉自身結(jié)合的鐵離子。這表明重組人乳鐵蛋白具有與天然人乳鐵蛋白類似的鐵結(jié)合與釋放能力。重組人乳鐵蛋白具有抑菌活性，當大腸桿菌菌濃度為1×105CFU/mL時，加入終濃度為5mg/mL的重組人乳鐵蛋白能明顯抑制細菌的生長。除重組人乳鐵蛋白外，固定化β-丙氨酸可從人乳，天然牛乳和羊乳中純化乳鐵蛋白，表明該介質(zhì)可用于不同種屬乳鐵蛋白的親和純化。
5、以上結(jié)果表明，利用固定化β-丙氨酸親和介質(zhì)可以大規(guī)模純化具有天然生物學活性的重組人乳鐵蛋白，并且可以應用于從人乳，天然牛乳和羊乳等乳汁中純化不同種屬的乳鐵蛋白。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因牛乳，重組人乳鐵蛋白，仿生親和配體，親和純化------------II------------上海交通大學碩士分析生學位論文AffinityPurificationofLactoferrinbySyntheticligandABSTRACTHumanlactoferrinisa70~80kDairon‐bindingglycoprotein
6、ofthetransferringfamilywithantibacterial,antifungal,antiviral,antitumorandimmunomodulatingactivities.Owingtoitsimplicationsinthesefunctions,humanlactoferrinhasbeenconsideredawidevarietyofapplicationsinfoodandhumanhealthcare,butitsapplicationsarerestrictedbeca
7、useofthelimitedsource.Recently,acattlemammaryglandbioreactorexpressingrecombinanthumanlactoferrinhasbeengeneratedbyaresearchgroupledbyDr.LiNingatChineseAgriculturalUniversity,thelevelofrecombinanthumanlactoferrinexpressedbytransgeniccattlecouldreachashighas2.
8、529±0.212mg/mL～3.429±0.417mg/mL,whichprobablyprovidedapowerfulapproachtoachievelarge-scaleproductionofrecombinanthumanlactoferin-----------inthemilkoftransgeniccows.Thepurposeofthisstudyi
