pi3k2fgsk3β信號通路介導(dǎo)心肌營養(yǎng)素1對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用

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1、摘要目的：通過研究體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，利用心肌細(xì)胞急性缺氧復(fù)氧模型模擬心肌缺血再灌注損傷，通過觀察CT-1(Cardiotrophin一1)對急性缺氧復(fù)氧時心肌細(xì)胞成活率，心肌細(xì)胞凋亡，心肌肌酸激酶，線粒體模電位(a1l，m)等的影響，探討cT一1在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中所起的作用及機(jī)制，通過CT一1信號通路PI-3K／GSK3B阻斷劑LY294002干預(yù)，從分子水平闡明PI一3K／GSK3B介導(dǎo)心肌營養(yǎng)素一1對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的保護(hù)作用。方法：1．乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)：取出生1-3天的SD大鼠心肌組織，按改良的S

2、impson等方法進(jìn)行分次水浴攪拌消化，差速貼壁法純化心肌細(xì)胞，以1×106／om2的細(xì)胞密度接種于35mm培養(yǎng)皿。2．缺氧復(fù)氧模型的建立：心肌細(xì)胞生長接近會合狀態(tài)，呈現(xiàn)同步搏動時開始實(shí)驗(yàn)。模擬缺血溶液配制缺氧液，以95％N：一5％C0：預(yù)飽和1h，將培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)缺氧液缺氧3h，之后換成復(fù)氧液培養(yǎng)3h。3．實(shí)驗(yàn)分組：(分5組)(1)對照組：更換培養(yǎng)基后CO：孵箱中正常培養(yǎng)；(2)缺氧復(fù)氧組：缺氧3h，復(fù)氧3h處理；(3)缺氧復(fù)氧+CT一1組：缺氧3h后，加CT一1(10ng／m1)進(jìn)行復(fù)氧3h處理；(4)缺氧復(fù)氧+C

3、T-l+LY294002組(P13K／GSK3B阻斷劑)：缺氧3h，加入終濃度為lOumol／1的LY294002，lOmin后加C，I．-1(10ng／m1)，再進(jìn)行復(fù)氧3h處理；(5)缺氧復(fù)氧組+CT—I+DMSO組：缺氧3h，加DMSO(助溶劑)lOmin后加CT一1(10ng／m1)，進(jìn)行復(fù)氧3h處理。結(jié)果1．心肌細(xì)胞搏動頻率與節(jié)律：各組基線心肌細(xì)胞搏動頻率均為148次／分左右，各組無明顯差異，節(jié)律規(guī)整。缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞搏動頻率教復(fù)氧前明顯減緩，搏動幅度減弱，節(jié)律不規(guī)整。CT-I處理組搏動頻率與缺氧復(fù)氧前比

4、較無明顯減慢，與對照組相近，節(jié)律整齊。而阻斷劑LY294002干預(yù)后，頻率明顯減Il摘要慢，搏動幅度減弱，節(jié)律明顯不規(guī)則，而助溶劑DMSO并不干擾CT一1的作用。表明LY294002特異性阻斷了C1’一1對缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。2。心霆蘧細(xì)胞的損傷：對照組心肌細(xì)胞存活率為96．2--+3．2％，凋亡率為2．8-+O．4％。缺氧復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞存活率明顯降低，為76．8±4．6％，心肌細(xì)胞凋亡率明顯上升(19．4士2．3％)，二者差異有顯著意義(P

5、1處理的心肌細(xì)胞，明顯抑制LDH，CK-船的升高和凋亡的增加，存活率較缺氧復(fù)氧組明顯升高(89．8±8．3％VS78+8±4．6％，P

6、是50．13±5．82VS69．13±6．84，54．51±6．62VS69．13±6．84，P均

7、。197±0．029VS0．986±0093，PO．05)，表明CT一1激活了P13K途徑使磷酸化P13K蛋白水平表達(dá)舞高。5。心肌細(xì)胞GSK38蛋自表達(dá)和磷酸化狀態(tài)：各組經(jīng)3小時缺氧，3小時復(fù)氧壓，心肌細(xì)胞GSK3B蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但缺氧復(fù)氧組較空白對照組磷酸化GSK3B蛋白表達(dá)明顯減少，而CT一1組較缺氧復(fù)氧組顯著上升，加P13K／GSK3B阻斷劑后磷酸化GSK3§蛋白表達(dá)明顯減少，而勁溶劑組與CT-1

8、組無明顯差異，表明CT-1有促進(jìn)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞磷酸化的作用，P13K／GSK3B阻斷劑可以抑制CT-1的這種作用。6．心艦細(xì)胞Caspases3蛋白表達(dá)：各組蛋自上樣量無明顯差異，經(jīng)缺氧復(fù)氧后，缺氧復(fù)氧組較空自對照組Caspases3蛋自表達(dá)明顯升高(0．953±0．015VS0．329±0．017，P