人骨骼肌成肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

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1、摘要中文摘要由于心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不能再生，而且心臟內(nèi)沒有心肌于細(xì)胞，因此心肌細(xì)胞損傷后只能通過瘢痕組織來修復(fù)，大量有收縮功能的細(xì)胞流失必然造成心室重構(gòu)和心功能降低，最后導(dǎo)致患者終末期心力衰竭(chronicheartfailure，CHF)，死亡。目前治療心衰的方法很多，包括藥物、PTCA支架置入術(shù)和冠狀動脈旁路移植術(shù)(cABG)、心臟移植及基因治療等，可通過降低心肌耗氧量、增加心肌血供、增強(qiáng)心肌收縮力及減輕心室重構(gòu)等方法一定程度上延長患者生存期，但均不能從根本上解決心肌丟失的問題，不能逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，使治療效果受到限制。近年來，利用細(xì)胞移植的方法重塑壞死區(qū)的心肌結(jié)構(gòu)受到廣泛

2、的關(guān)注，但由于供體的匱乏和異體移植帶來的排斥反應(yīng)，使胚胎心肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或成體干／祖細(xì)胞受到很大限制。而骨骼肌成肌細(xì)胞可自體移植，不受供體來源限制，不需免疫抑制，故備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)旨在探索高效的人骨骼肌成肌細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，為臨床應(yīng)用自體成肌細(xì)胞移植治療心衰打下良好基礎(chǔ)。方法：1．采用組織塊反復(fù)貼壁法原代培養(yǎng)人骨髂肌成肌細(xì)胞，觀察成肌細(xì)胞生長的形態(tài)學(xué)變化；2．利用骨骼肌特異性標(biāo)記物肌動蛋白(Actirt)及結(jié)蛋白(desmin)對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定；3．將原代培養(yǎng)的成肌細(xì)胞多次傳代，同時(shí)對原代及傳代培養(yǎng)的成肌細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制其生長曲線，觀察成肌細(xì)胞增殖分化特性；4．探索成肌

3、細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的方法。結(jié)果：1．形態(tài)學(xué)觀察：采用組織塊貼壁培養(yǎng)法，肌組織塊接種于培養(yǎng)瓶5天后可見長梭形、紡錘形單核成肌細(xì)胞緩慢向組織塊外生長，第6天后單核雙極性成肌細(xì)胞向組織塊外大量擴(kuò)展呈鋪開狀放射樣分布，生長迅速，遠(yuǎn)離組織塊區(qū)域的成肌細(xì)胞可里典型的克隆樣生長和簇狀分布，表現(xiàn)出很強(qiáng)的分裂增殖生長特性。8—10天后，大量增殖的成肌細(xì)胞相互融合，形成核位于中央的多核性長管狀初生肌管。因此上述原代培養(yǎng)的肌細(xì)胞成肌過程大致分為緩慢生長期、分裂增殖期及肌管形成期3個(gè)不同的生長增殖分化期，時(shí)間分別為培養(yǎng)的第1-5天、6--8天、8--10天。在保持適宜的細(xì)胞密度和細(xì)胞培養(yǎng)條件下，組織塊至少可以

4、反復(fù)貼壁12次，而細(xì)胞形態(tài)保持不變。2．免疫組織化學(xué)鑒定：骨骼肌特摘要異性標(biāo)記物肌動蛋白(Actin)和結(jié)蛋白(desmin)免疫組化鑒定為陽性，證實(shí)了培養(yǎng)細(xì)胞的骨骼肌來源。3．骨骼肌成肌細(xì)胞增殖分化特性：采用組織塊反復(fù)貼壁培養(yǎng)法，肌組織塊貼壁后5天即開始有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，6—8天時(shí)生長旺盛，10天時(shí)長滿瓶底，可達(dá)1．6×104／cm2；原代培養(yǎng)細(xì)胞共貼壁12次，隨著貼壁次數(shù)增多，細(xì)胞爬出的速度增快，約在第10次時(shí)最快，3天即可見有細(xì)胞爬出。原代培養(yǎng)的細(xì)胞至少可以傳代20次以上，在第10～15代時(shí)細(xì)胞增殖最為迅速，細(xì)胞倍增時(shí)間為24小時(shí)。4．凍存與復(fù)蘇：成肌細(xì)胞凍存、復(fù)蘇后生

5、長良好，仍可保持原有形態(tài)及增殖分化特性。結(jié)論：與酶消化法相比，組織塊貼壁法簡便、可行，耗材少，時(shí)間短、成本低。該方法實(shí)用性強(qiáng)，可在短時(shí)間內(nèi)得到大量的高純度的成肌細(xì)胞，是原代培養(yǎng)人骨骼肌成肌細(xì)胞的較好方法。同時(shí)，可通過適當(dāng)?shù)膬龃婕皬?fù)蘇方法使培養(yǎng)細(xì)胞得以長時(shí)間保存，為適時(shí)臨床細(xì)胞移植治療打下良好基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：骨骼肌成肌細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)組織塊反復(fù)貼壁法增殖凍存復(fù)蘇IIAbstractAbs仃actMaturemyocardialtissuesdoesnotpossesstheabilitytoeffectivelyregenerateafterischemicinjury．Asaresult

6、，thenormalprogressionofinjuredmyocardiuminvolvesdevelopmentoffibrous，nonconstractilescartissue，leadingtoventricularremodeling，whichCallcauseaneurysmformationandend—stageheanfailure，evendeath．Nowtherearemanytreatmentsforheartfailure，includingdrugs、PTCA、hearttransplantion、genetherapyete，whichare

7、unabletoreconstructinjuredmyocardium．Transplantionreversecellsintoinfractedregionofmyocardiumoffersthehopeofrestoringsomeventricularfunction．Thistechniquehasbeenlabeledcellularcardiomyoplasty．Theaimofthisstudyistoexploreanexperimentalme