漿細(xì)胞腫瘤教學(xué)ppt課件

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1、免疫膠體金技術(shù)ImmunogoldTechnique一.概述(一)發(fā)展歷史1971年Faulk和Taylon用兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合,制備成金標(biāo)抗體,檢測細(xì)菌表面抗原的分布1975年Horisberger等把膠體金技術(shù)推廣應(yīng)用于掃描電鏡、透射電鏡及冰凍蝕刻電鏡的研究1978年Geoghegan發(fā)表了膠體金標(biāo)記物在光鏡水平的應(yīng)用1981年Danscher建立了銀顯影液增強(qiáng)，光鏡下金顆?？梢娦缘姆椒?983年Moeremans等在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳中應(yīng)用了免疫金銀染色法1986年Fritz等在免疫金銀法基礎(chǔ)上成功進(jìn)行了彩色免疫金銀染色免疫膠體金技術(shù)以膠體金為標(biāo)記物應(yīng)用在

2、免疫組織化學(xué)研究中，對細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)、多肽、激素和核酸等生物大分子進(jìn)行定位研究（二）膠體金的基本概念膠體金，一般指金的水溶液，又稱金溶膠。---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶膠。其中分散的金顆粒直徑在1~100nm之間。二.膠體金的制備(一)可用多種方法制備膠體金分散法:包括機(jī)械分散法、超聲波法、電分散法和膠溶法等凝聚法:包括物理凝聚法、化學(xué)凝聚法（氧化法、水解法和還原法）其中應(yīng)用最多的是化學(xué)還原法化學(xué)還原法【基本原理】在氯化金水溶液中加入一定量的還原劑，使金離子還原為金原子。在適當(dāng)條件下，還原的金原子凝聚成一定大小的金顆粒，形成金溶膠。【常用

3、還原劑】檸檬酸鈉、鞣酸、白磷等檸檬酸鈉還原制備的金顆粒直徑較大，15~150nm白磷還原制備的金顆粒直徑較小，3~12nm【具體制備方法】（二）影響溶膠穩(wěn)定性的因素電解質(zhì)膠體金濃度溫度大分子物質(zhì)（三）膠體金的鑒定【鑒定方法】在電鏡下觀察金顆粒的大小及金顆粒的均勻程度【鑒定方法】將膠體金滴在覆有Formvar膜或碳-Formvar膜的鎳網(wǎng)上，空氣干燥，透射電鏡下觀察，拍照，測量金顆粒的直徑，并計(jì)算100個(gè)以上膠體金顆粒直徑的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差（四）制備膠體金的注意事項(xiàng)1.玻璃器皿的清潔2.試劑配制3.影響膠體金顆粒大小的因素玻璃器皿清洗→清潔液浸泡24h→流水沖→蒸餾水反復(fù)洗滌→

4、晾干應(yīng)盡量使用分析純試劑各種水溶液必須用三蒸水或去離子水配制加入還原劑的速度攪拌是否均勻制備膠體金所用的燒瓶大小三.膠體金探針的制備(一)膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的過程,實(shí)際上是蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)或稍偏堿時(shí),被吸附于膠體金顆粒表面.（二）膠體金的預(yù)處理標(biāo)記之前將膠體金的PH值調(diào)至待標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或略偏堿調(diào)節(jié)PH的方法：當(dāng)需要提高膠體金的PH值時(shí)，用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LKOH當(dāng)需要降低膠體金的PH值時(shí),用0.1MHCL或醋酸(三)待標(biāo)記蛋白質(zhì)的處理1.透析除鹽:將蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中,放在蒸餾水中透析,4℃過夜2.離心:10000r/m

5、in,4℃,1h,去除蛋白質(zhì)聚合物等沉淀(四)膠體金蛋白質(zhì)最佳結(jié)合率測定不同直徑的金顆粒,及不同分子量大小的蛋白質(zhì),其結(jié)合的比例是不同的常用的檢測二者結(jié)合量的方法有目測法和光電比色法1.目測法先將待標(biāo)記蛋白質(zhì)逐級稀釋取一批小試管，編號，每管內(nèi)加已調(diào)好PH的膠體金100ul按從低→高的濃度，將已稀釋好的蛋白溶液，分別加入已編號的試管中，對照管只加不含蛋白的稀釋液，混勻，靜置5~10min各管分別加10%NaCl10μl，混勻，靜置2hr，觀察結(jié)果1234576膠體金(ml)1111111蛋白質(zhì)(ug)510152025303510%NaCl0.10.10.10.10.10.1

6、0.1結(jié)果判斷:對照管或加入蛋白量不足，膠體金出現(xiàn)由紅變藍(lán)的凝聚現(xiàn)象；加入蛋白質(zhì)量達(dá)到或超過穩(wěn)定量，則膠體金保持紅色不變2.光電比色法利用分光光度計(jì)測各管580nm的OD值,然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作一曲線,取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)的蛋白質(zhì)濃度,即為最適穩(wěn)定量.(五）標(biāo)記1.計(jì)算所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金溶液總體積及所測定的最適蛋白質(zhì)穩(wěn)定量，計(jì)算出所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量2.調(diào)節(jié)PH：根據(jù)所標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來調(diào)節(jié)膠體金的PH常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金的PH蛋白質(zhì)PH抗體9.0SPA6.0過氧化物酶8.0低密度脂蛋白5.53.磁力攪拌下，

7、逐滴加入蛋白質(zhì)溶液，作用5～15min4.繼續(xù)磁力攪拌，加入5％牛血清白蛋白，使其終濃度為1％，攪拌10min；也可加3％聚乙二醇，使其終濃度為0.05％（六）標(biāo)記探針的純化純化的目的去除溶液中未標(biāo)記的蛋白質(zhì)，未充分穩(wěn)定的膠體金，以及在標(biāo)記過程中可能產(chǎn)生的各種聚合物純化的方法超速離心法和凝膠過濾法1.超速離心法速度快，適合大樣品的制備離心1500rmin，20min棄沉淀超速離心4℃1h棄上清沉淀用PBS或TBS緩沖液（含0.1％牛血清白蛋白重新懸浮至原體積的110～120離心1500rmin，20min棄沉淀分裝