藍(lán)舌病病毒17型vp2蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定

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1、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文摘要藍(lán)舌病(bluetongue,BT)是一種由藍(lán)舌病病毒(bluetonguevirus,BTV)引起的通過庫蠓等昆蟲傳播的非接觸性病毒性動(dòng)物傳染病。主要感染反芻動(dòng)物,為畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,是國內(nèi)外動(dòng)物疫病防疫監(jiān)測的重點(diǎn)。全世界共分離到至少24個(gè)血清型BTV,且各型問無交叉反應(yīng),因此快速的血清型檢測方法的建立是預(yù)防本病的關(guān)鍵,以便針對當(dāng)?shù)亓餍械难逍瓦x擇相應(yīng)疫苗控制本病。根據(jù)GenBank中已發(fā)表BTVl7的L2基因序列(M17438.1)設(shè)計(jì)l對引物,從感染BTVl7的BHK-21細(xì)胞中提取病毒RN

2、A,RT-PCR擴(kuò)增L2基因。利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP2蛋白。將L2基因克隆至pFastBacHTA供體質(zhì)粒,構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pFast-VP2。重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHl0Bac感受態(tài)細(xì)胞,獲得重組桿粒BAC.V】P2。將重組桿粒轉(zhuǎn)染s侈昆蟲細(xì)胞,得到攜帶L2基因的重組桿狀病毒BACV-VP2。對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE和WesternBlot分析,結(jié)果顯示VP2蛋白在S侈昆蟲細(xì)胞中得到成功表達(dá),且重組蛋白主要以包涵體形式存在。重組VP2蛋白能夠與抗BTVl7綿羊陽性血清發(fā)生反應(yīng),顯示出良好的抗原性.根據(jù)

3、GenBank中已發(fā)表的BTvl7的L2基因序列0V117438.1)設(shè)計(jì)兩對引物,利用原核表達(dá)系統(tǒng)對L2基因進(jìn)行分段表達(dá)。利用兩對引物以重組供體質(zhì)粒pFast-VP2為模板擴(kuò)增出兩段目的基因A和B。將A和B基因分別克隆到原核表達(dá)載體pET-30a中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-A和pET-B。將pEBA和pET-B分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌BL21表達(dá)重組蛋白VP2-A和VP2-B。SDS-PAGE結(jié)果顯示重組蛋白VP2-A和VP2-B均能在大腸桿菌中得到大量表達(dá),主要以包涵體形式存在。表達(dá)產(chǎn)物以8M尿素變性后利用

4、Ni2+NTA樹脂對其進(jìn)行變性純化。Westernblot結(jié)果表明兩段重組蛋白均能與抗BTVl7綿羊陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具備良好的抗原性。以原核表達(dá)的重組蛋白VP2-A和VP2-B為免疫原共同免疫BALB/c小鼠,并通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)將免疫后小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。以原核表達(dá)的兩段重組蛋白為主要檢測抗原,建立間接ELISA檢測方法篩選分泌抗VP2蛋白單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細(xì)胞。將第一次篩選到的陽性克隆以真核表達(dá)的重組VP2蛋白為檢測抗原,通過間接ELISA方法進(jìn)一步篩選,最終獲得2株能穩(wěn)定分泌抗BTVl7VP2蛋

5、白MAb的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為BTVl7VP2·3F4、BTVl7VP2-4H10(以下簡稱為3F4和4H10)。Westernblot結(jié)果表明2株MAbs均與重組蛋白VF2-A和VP2.B發(fā)生特異性反應(yīng),而與空載體表達(dá)產(chǎn)物對照不發(fā)生反應(yīng),具備良好的反應(yīng)原性。間接免疫熒光結(jié)果表明,2株MAbs均與BTvl7呈陽性反應(yīng),其中MAb3F4與BTvl~9、BTVll~23、茨城病病毒、中山病病毒、赤羽病病毒、牛輪狀病毒、牛呼腸孤病毒均呈陰性反應(yīng),與BTVl0和BTV24呈弱陽性反應(yīng)。利用合成肽方法對2株MAbs所識別的BTVl7VP2蛋

6、白的抗原表位進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明,MAb31:4識別的抗原表位為540DPWNNR545,MAb4H10識別的抗原表位為唧WN卜限A螄。本研究制備的2株BTVl7VP2蛋白MAbs及所鑒定的抗原表位,為BTvl7型特異性檢測方法的建立及BTVl7VP2蛋白功能研究提供了基礎(chǔ),對BT的防控具有重要意義。關(guān)鍵詞:藍(lán)舌病病毒血清17型,VP2蛋白,單克隆抗體,抗原表位中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文摘要AbstractBluetonguevires①TnanorbivirusoftheReoviridaefamilyencompassing24k

7、nownseroDfpes,causesahacmorrhagicdiseasemainlyinsheepandoccasionallyincattle.BTvistransmittedbetweenitsmammalianhostsbycertainspeciesofbitingmidgesanditcaninfeetallruminantspecies.BTrepresentsamajorbarriertointernationaltradeinanimalsandsomeanimalpredum,causingworldwide

8、economiclosses.So,itisimportanttoestablishBTVserotype-specificdetectionmethodforusingvaccinesofthehomologousBT

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