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《藍(lán)舌病病毒15型vp2、ns3蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、密級(jí)：論文編號(hào):中囯農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文藍(lán)舌病病毒15型VP2、NS3蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定PreparationoftheMonoclonalAntibodiesagainstVP2andNS3ProteinofBluetongueVirusSerotype15andIdentificationofB-cellEpitopes碩士研究生.?賂6指導(dǎo)教師：吳東來研宄員申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向：獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)培養(yǎng)單位：哈爾濱獸醫(yī)研究所中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研宄生院2015年S月密級(jí):論文編號(hào):中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文藍(lán)舌病病毒15型VP2、NS3蛋白單克隆抗體
2、的制備及其抗原表位的鑒定PreparationoftheMonoclonalAntibodiesagainstVP2andNS3ProteinofBluetongueVirusSerotype15andIdentificationofB-cellEpitopes碩士研究生：張沁指導(dǎo)教師：吳東來研究員申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向：獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)培養(yǎng)單位：哈爾濱獸醫(yī)研究所中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationPreparationoftheMonoclon
3、alAntibodiesagainstVP2andNS3ProteinofBluetongueVirusSerotype15andIdentificationofB-cellEpitopesM.S.Candidate：ZhangQinSupervisor：Prof.WuDong-LaiDegree：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2015摘要藍(lán)舌?。˙luetonguedisease,BT）是由藍(lán)舌病病毒（Bluetonguevirus,BTV）引起的，由傳播媒介
4、庫蠓在動(dòng)物間廣泛傳播的急性、烈性動(dòng)物傳染病。該病主要感染反芻動(dòng)物（山羊、綿羊、牛、鹿、駱駝等），其中以綿羊最易感，病畜被感染后主要表現(xiàn)出高熱、口腔黏膜發(fā)紺充血、面部水腫等癥狀，部分血清型可引起較高的死亡率。目前，BTV已多達(dá)27個(gè)血清型，各血清型之間無交叉保護(hù)作用，所以制備出針對(duì)某一特定血清型的BTV相關(guān)的診斷試劑是防治該病的最有效措施。BTV屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的成員，其基因組由10個(gè)分節(jié)段的雙股正鏈RNA組成，分別編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1~VP7）和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a及NS4)。其中，VP2能刺激產(chǎn)生型特異性中和抗體，NS3/NS3a參與病毒的釋放。根據(jù)
5、Genbank中登陸的BTV15L2基因序列（CAE51102.1）及S10基因序列（AGJ83560.1）分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的分別含有BTV15的VP2編碼序列以及NS3編碼序列的重組質(zhì)粒pZERO-B15-VP2和PEASY-B15-NS3為模板擴(kuò)增VP2與NS3蛋白的編碼基因。并將兩者酶切處理后克隆于原核表達(dá)載體pMAL-C4X，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pC4X-B15-VP2和pC4X-B15-NS3。另TM外，將L2基因克隆于真核表達(dá)載體pFastBacHTA用于真核表達(dá)VP2蛋白；將S10基因克隆于原核表達(dá)載體PET-30a，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PET-B15-NS3。四種蛋
6、白表達(dá)純化完成后，將原核重組VP2蛋白MBP-VP2和原核重組NS3蛋白HIS-NS3分別免疫4-6周齡的BALB/c小鼠以制備單克隆抗體（Monoclonalantibody，MAb）。取抗體滴度較高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，并分別以真核重組VP2蛋白BAC-B15-VP2和原核重組NS3蛋白MBP-NS3為包被抗原，以間接ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，最后獲得3株穩(wěn)定分泌抗BTV15VP2蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為2C6、2D6、3B11；獲得4株穩(wěn)定分泌抗BTV15NS3蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞。分別命名為1B5、2B12、2G9、3D8。利用western-blot
7、（WB）和IFA試驗(yàn)對(duì)上述MAbs進(jìn)行特異性鑒定，WB結(jié)果表明7株MAbs都能識(shí)別BTV15感染的BHK-21細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)蛋白；IFA結(jié)果表明2C6、2D6、3B11只與BTV15反應(yīng)，而不與其他血清型BTV反應(yīng)，而1B5、2B12、2G9、3D8與BTV1~24均發(fā)生反應(yīng)。利用肽掃描技術(shù)6266對(duì)該幾株MAbs識(shí)別的B細(xì)胞表位進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明2C6識(shí)別的抗原表位為L(zhǎng)KYRP，2D6識(shí)別1524
