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《藍(lán)舌病病毒12型ns1蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、密級:論文編號:中囯農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文藍(lán)舌病病毒12型NS1蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定PreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNS1ProteinofBluetongueVirus12andIdentiilcatioiiofB-cellEpitopes碩士研宄生：王海秀指導(dǎo)教師：吳東來研宄員申請學(xué)位類別：獸醫(yī)碩士專業(yè)領(lǐng)域名稱：獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)培養(yǎng)單位：哈爾濱獸醫(yī)研宄所研究生院2⑩15年5月密級:論文編號:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文藍(lán)舌病病毒12型N
2、S1蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定PreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNS1ProteinofBluetongueVirus12andIdentificationofB-cellEpitopes碩士研究生：王海秀指導(dǎo)教師：吳東來研究員申請學(xué)位類別：獸醫(yī)碩士專業(yè)領(lǐng)域名稱：獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)培養(yǎng)單位：哈爾濱獸醫(yī)研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertati
3、onPreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNS1ProteinofBluetongueVirus12andIdentificationofB-cellEpitopesM.S.Candidate：WangHaixiuSupervisor：Prof.WuDonglaiDegree：MasterofVeterinarianSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2015摘要藍(lán)舌?。˙luetong
4、uedisease,BT）是由藍(lán)舌病病毒（Bluetonguevirus,BTV）引起的一種蟲媒傳染病，可以引起綿羊等反芻動物的出血性疾病，主要通過庫蠓等昆蟲叮咬傳播，偶爾通過精液和胎盤傳播。BTV基因組的多樣性和節(jié)段性增加了病毒復(fù)制和組裝過程中基因重組的可能性，目前已發(fā)現(xiàn)27個不同的血清型，并且同一血清型內(nèi)含有大量的變異毒株。此外，全氣候變暖引起庫蠓等分布范圍的變化，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)爆發(fā)BT的可能性增加。與環(huán)狀病毒屬其他成員一致，疫苗免疫是預(yù)防BT和BTV傳播最有效的途徑，但是BTV血清型之間具有很
5、大的抗原差異性，彼此之間缺乏有效的免疫保護(hù)性。因此，制備具有型特異和群特異的單克隆抗體（monoclonalantibody，MAbs）為開發(fā)更好的診斷和研究試劑奠定基礎(chǔ)，在BT防控方面具有重要意義。BTV基因組由10個分節(jié)段的雙鏈RNA組成(Seg-1～Seg-10)，其中S5基因編碼的NS1蛋白在BTV各血清型之間高度保守。本研究利用實驗室保存的攜帶BTV12S5基因的重組質(zhì)粒pEASY-NS1-BTV12為模板（GenBank登錄號：KM485310）設(shè)計上下游引物，PCR擴(kuò)增獲得S5基因編碼
6、區(qū)，獲得的目的基因進(jìn)行酶切后分別克隆轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)載體pET-30a和桿狀病毒表達(dá)TM載體pFastBacHTA，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-NS1-BTV12和pFAST-NS1-BTV12。將重組質(zhì)粒pET-NS1-BTV12轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，利用0.5mMIPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)重組BTV12NS1蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示原核重組NS1蛋白（rP-NS1-BTV12）2+以包涵體形式表達(dá)。使用NiNTA樹脂對其進(jìn)行純化，Westernblot（WB）驗證重組NS1
7、蛋白能與本實驗室保存的BT陽性羊血清發(fā)生反應(yīng)。將重組質(zhì)粒pFAST-NS1-BTV12轉(zhuǎn)化至E.coliTMDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿粒（rBacmidDNA）。將rBacmidDNA轉(zhuǎn)染至sf21昆蟲細(xì)胞，得到高效表達(dá)S5基因的重組桿狀病毒BACV-NS1。SDS-PAGE結(jié)果顯示sf21昆蟲細(xì)胞成功表達(dá)重組NS1蛋白（rE-NS1-BTV12），同樣以包涵體形式存在。電洗脫法洗脫純化重組NS1蛋白，所獲得蛋白同樣可以與BT陽性羊血清發(fā)生反應(yīng)。利用免疫BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0
8、骨髓瘤細(xì)胞融合技術(shù)獲得雜交瘤細(xì)胞，并通過間接ELISA篩選出25株穩(wěn)定分泌抗NS1蛋白的雜交瘤細(xì)胞株。WB結(jié)果顯示，25株MAbs與rP-NS1-BTV12和rE-NS1-BTV12均呈陽性反應(yīng)，而與只表達(dá)空載體pET-30a和野生型桿狀病毒的蛋白呈陰性反應(yīng)。IFA顯示25株MAbs中22株雜交瘤細(xì)胞與BTV12呈陽性反應(yīng)，而3株雜交瘤細(xì)胞（(2B7、3E9和4B9)）與BTV12呈陰性反應(yīng)。22株陽性雜交瘤細(xì)胞中6株雜交瘤細(xì)胞(1F11、2F2、2C11、3C2、3
