大鯢蛙病毒lamp檢測方法的建立與應用

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1、萬方數(shù)據(jù)ClassificationNumber$941．41StudentNumberS2Q!!三Q22SichuanAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationDevelopmentandapplicationofLoop·-MediatedIsothermalAmplificationfordetectionofChineseGiantSalamanderRanavirusByLiuXing--xingDirectedbyProf．GengYi(BasicVeterinaryMedic

2、ine)Sichuan，Ya’an，ChinaJune，2014刪0嗍1萬方數(shù)據(jù)0刪22J12一本研究由四川省科技支撐項目(2014NZ0027)資助。ThisstudyissupportedbySichuanTechnologySupportPlanning(2014NZ0027)．萬方數(shù)據(jù)論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文是我個人在導師指導下進行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，學位論文中不包含其他／卜人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得四川農業(yè)大學或其它教育機構的學位或證書所

3、使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：斟盈是幻f中年∥月妒日關于論文使用授權的聲明本人完全了解四川農業(yè)大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意四川農業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內容。研究生簽名：導師簽名：翮咎丑孑善；>．，r甲年r月P日彥，，e年f月G日萬方數(shù)據(jù)中文摘要大鯢fAndriasdavidia

4、nusBlanchard)俗名“娃娃魚”，屬于兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科、大鯢屬，是我國現(xiàn)存最大的也是最珍稀的物種，并被列為國家1I類重點保護野生動物。我國在上個世紀70年代對大鯢進行馴養(yǎng)和繁殖試驗，隨著大鯢人工繁殖的成功，大鯢養(yǎng)殖在陜西、四川、湖南、重慶、甘肅等省市快速發(fā)展，并逐步成為優(yōu)勢特色產業(yè)。大鯢蛙病毒(ChineseGiantSalamanderRanavims，CGSRV)是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種嚴重危害大鯢養(yǎng)殖的新型病原微生物，它感染大鯢主要表現(xiàn)為體表出現(xiàn)潰瘍及大量的出血斑點，頭部與四肢出現(xiàn)腫脹，有時形成潰瘍灶，被人們稱為“潰瘍病

5、或大腳病”，一旦發(fā)病，很難治愈，死亡率高，甚至高達100％，故被養(yǎng)殖戶們稱為“大鯢的癌癥”。本研究建立了大鯢蛙病毒的LAMP檢測方法，以期為CGSRV的早期、快速、特異性診斷及該病的預警提供技術保障。根據(jù)GenBank中登錄大鯢蛙病毒MCP基因序列(登錄號：HQ684746)，利用LAMP引物設計網(wǎng)站(primerExplorerV4(http：／／primerexplorer．jp／e／)設計4條特異性引物：F3：5’一GAGGGcGTACTTTTGGGC一3’；B3：5’一ATGCCACCTCCATCCCA．3’：FIP：5'-TAA

6、CGTCACCCTGTCCGCTGA—CAGAGTTGTCACCTCCGC．3’：BIP5'-TCTGCCGTAATTGGTGGATCCG-GGCACCACCTCTACTCCTA．3’。經(jīng)過對M92+濃度、引物濃度、dNTPs濃度和BstDNA聚合酶濃度、反應溫度、反應時間進行優(yōu)化，成功建立了CGSRV的LAMP檢測方法。最佳反應溫度為62。C，最佳反應時間為40min，反應體系為259L，llxLF3(IOgM)，(B3(10pM)，(FIP(50¨M)，(BIP(509M)，3．5燦dNTPs(25mM)，49L10xThermopo

7、lbuffer，8UBstDNA聚合酶，31aLMgCl2(25mM)，2止模板DNA和7．51．tLddH20。結果表明，該LAMP方法對CGSRV最低檢測限5copies／gL，而巢氏PCR幣H常規(guī)PCR的檢測限為50copies／此和5x103copies／gL，表明該LAMP方法的靈敏度顯著高于巢氏PCR和常規(guī)PCR；且特異性強與錦鯉皰疹病毒、金魚皰疹病毒2型、云斑尖塘鱧虹彩病毒、鱖魚傳染性脾腎壞死病毒、遲鈍愛德華菌、嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌等均無交叉反應。在對經(jīng)普通PCR與巢氏PCR檢測陽性的55例疑似患蛙病毒感染樣本及8例陰

8、性樣本，采用建立的LAMP技術檢測發(fā)現(xiàn)，其結果與普通PCR及巢氏PCR的檢測結果一致。再運用以上三種方法對32例疑似樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，萬方數(shù)據(jù)LAMP反應檢測出30種，檢測率高達93．75％，