腸出血性大腸桿菌o157h7鞭毛蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備

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1、腸出血性大腸桿菌0157：H7鞭毛蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備ProkaryoticexpressionofE．coli0157：H7flagellinproteinandpreparationofmonoclonalantibodiesagainsttheflagellinprotein研究生：吳超導(dǎo)師：徐建生教授教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目揚(yáng)州大學(xué)2014．6吳超：腸出血性大腸桿菌0157：H7鞭毛蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備腸出血性大腸桿菌0157：H7鞭毛蛋白的原核表

2、達(dá)及單克隆抗體的制備研究生：吳超導(dǎo)師：徐建生教授中文摘要IIIIIIIIIIIIIIlltlIIIIIIlY2632271腸出血性大腸桿菌(EnterohaemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)O157：H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，能引起人類的腹瀉、出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagiccolitis，HC)、溶血性尿毒綜合癥(Hemolyticuremicsyndrome，HUS)及血栓性血小板減少性紫癜(ThromboticThrombocytopenicpurpura，TTP

3、)等嚴(yán)重疾病，可在動(dòng)物腸道內(nèi)長(zhǎng)期寄居，對(duì)人類的健康及畜牧業(yè)危害巨大。其感染流行已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。對(duì)于該病的防范不可懈怠，所以建立一種快速、準(zhǔn)確、便捷的診斷檢測(cè)方法十分必要。H7蛋白為EHEC0157：H7的鞭毛蛋白，決定著大腸桿菌的血清型。有關(guān)研究表明，EHEC0157：H7與結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞或者黏液結(jié)合的過程發(fā)生在菌體在動(dòng)物體內(nèi)定植的早期，而鞭毛在這期間起著物理性的連接點(diǎn)的作用。而其在誘導(dǎo)產(chǎn)生天然的免疫反應(yīng)的同時(shí)可產(chǎn)生前炎癥因子，并且可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的免疫反應(yīng)。所以，H7鞭毛全長(zhǎng)蛋白

4、在制備特異性的檢測(cè)抗體時(shí)是不可或缺的免疫原。在國內(nèi)外之前的研究中用類似免疫方法制備的EHEC0157：H7單克隆抗體大多是針對(duì)菌體及致病因子等抗原的單克隆抗體，而對(duì)H7鞭毛抗原的卻不多。大腸埃希菌中含有許多菌體抗原為0157而鞭毛抗原非H7的大腸埃希菌。因此，H7鞭毛抗原的檢測(cè)對(duì)于疑似菌株的鑒定十分重要。單克隆抗體技術(shù)在近年來的基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。在疾病的診斷與治療方面，單克隆抗體成為眾多研究者研究中必不可少的工具。在免疫學(xué)方面，特異性強(qiáng)、靈敏度高，且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)是單克隆抗體相比于多克隆抗

5、體的優(yōu)勢(shì)。目前單克隆抗體已在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境等眾多領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用。本研究通過基因工程方法擴(kuò)增出EHEC0157：H7鞭毛蛋白的全基因片段，大小為1755bp。將目的片段插入到表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a．Flic。將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌E．coliBL21(DE3)，37℃條件下，通過IPTG誘導(dǎo)4h后超聲波裂解菌液。揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文2經(jīng)SDS．PAGE分析，該融合蛋白在大腸桿菌E．coliBL21(DE3)中可以高效表達(dá)。表達(dá)的His．Flic．H7融合蛋白為預(yù)期的

6、66kD，且為可溶表達(dá)。通過Western．blot分析知鼠抗His標(biāo)簽單抗可以特異性識(shí)別該重組蛋白，說明該融合蛋白具有較好的免疫原性。通過鎳柱親和層析法純化融合蛋白后免疫BALB／c小鼠。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。His．Flic．H7融合蛋白及HiS標(biāo)簽蛋白包被酶標(biāo)板，常規(guī)間接Elisa法篩選出4孔能分泌抗Flic蛋白的細(xì)胞株，經(jīng)2次亞克隆后，獲得2株可穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株E4、G6。亞類鑒定均為IgM。通過免疫印跡及凝集試驗(yàn)鑒定抗體特異性良好。將2株細(xì)胞腹腔注射小鼠，獲得腹

7、水后進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)，Elisa結(jié)果顯示效價(jià)分別為214和213?？笶HEC0157：H7鞭毛蛋白的單克隆抗體的制備，為建立針對(duì)該細(xì)菌的特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：EHEC0157：H7；H7鞭毛蛋白；原核表達(dá)；單克隆抗體吳超：腸出血性大腸桿菌0157：H7鞭毛蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備3ProkaryoticexpressionofE．coliO157：H7flagellinproteinandpreparationofmonoclonalantibodiesagai

8、nsttheflagellinproteinM．D．Candidate：ChaoWuSupervisor：JianshengXuAbstractEnterohemorrhagicEscherichiacoli(EHEC)O157：H7belongingtotheEnterobacteriaceaeEscherichelloa．Itcancausediarrheainhumans、Hemorrhagiccolitis(HC)、Hemolyti