水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究

《水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

分類號(hào)UDC學(xué)校代碼10593學(xué)號(hào)1031304007彥匆火學(xué)學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究侯恩慶專業(yè)名稱植物病理學(xué)學(xué)院名稱農(nóng)學(xué)院指導(dǎo)教師黃世文(研究員)黎起秦(教授)申請學(xué)位級(jí)別碩士論文提交日期2013．06論文答辯El期2013．05．22學(xué)位授予日期2013．06答辯委員會(huì)主席廖詠梅(教授)論文評(píng)閱人雙盲評(píng)審 廣西大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)聲明刪本人聲明所呈交的論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除已特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含本人或他人為獲得廣西大學(xué)或其它單位的學(xué)位而使用過的材料。與我一同工作的同事對本論文的研究工作所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確說明。本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的學(xué)位論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬廣西大學(xué)。本人授權(quán)廣西大學(xué)擁有學(xué)位論文的部分使用權(quán)，即：學(xué)校有權(quán)保存并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于：口保密，在年解密后適用授權(quán)。函不保密。(請?jiān)谝陨舷鄳?yīng)方框內(nèi)打“√")論文作者簽名：名恩灰指導(dǎo)教師簽名：攆壺豢作者聯(lián)系電話：c卵爭爭67加易日期：幻l娣鉬切融日期陽，歲爭6月陽日電子郵箱：J!l眥吲侈阻；@，z多、鈿 廣西大掌碩士掌位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究摘要近年來，全國各稻區(qū)普遍發(fā)生一種危害稻穗和谷粒的病害一水稻穗腐病(Ricespikeletrotdisease，RSRD)。該病由多種真菌引起，造成稻米腐壞、變色、畸形，致使結(jié)實(shí)率降低或不實(shí)，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。還由于病原菌產(chǎn)生色素和毒素而改變稻谷外觀，降低稻米品質(zhì)。作者采集了浙江省杭州市和嘉興市兩地的水稻穗腐病樣本，共鑒定出5種病原鐮刀菌，并對各種鐮刀菌的生物學(xué)特性、脂肪酸組成和含量、致病力、產(chǎn)毒條件和產(chǎn)毒能力、粗毒素毒性、田間防治進(jìn)行了研究。獲得主要研究結(jié)果如下：1．水稻穗腐病鐮刀菌的分離和鑒定。共分離到216株鐮刀菌，利用培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征觀察和分子生物學(xué)手段共鑒定到5個(gè)鐮刀菌種，包括：層出鐮刀菌(Fproliferatum)、藤倉鐮刀菌(Efujikuroi)、擬輪枝鐮刀菌(Fverlicillioidess)、尖孢鐮刀菌(Eoxysporum)和禾谷鐮刀菌(Egraminearum)。其中，層出鐮刀菌(Eproliferatum)137株，占63．4％；藤倉鐮刀菌(Ffujikuroi)50株，占23．1％；擬輪枝鐮刀菌(Fverticillioidess)21株，占9．7％；尖孢鐮刀菌(Foxysporum)5株占2．3％；禾谷鐮刀菌(Fgraminearum)3株，占1．4％。通過Koch法則驗(yàn)證，各種鐮刀菌均能成功接種稻穗，使稻穗感染穗腐病。2．病原鐮刀菌生物學(xué)特性。禾谷鐮刀菌菌最適生長溫度是25。C，最適pH為6，最佳碳源是葡萄糖、蔗糖，最佳氮源是尿素、硝酸鈉；尖孢鐮刀菌最適生長溫度是25*(2，最適pH為6，最佳碳源是葡萄糖、蔗糖，最佳氮源是硝酸鈉；層出鐮刀菌最適生長溫度是25"C，最適pH為6，最佳碳源是蔗糖、葡萄糖，最佳氮源是硝酸鈉、亞硝酸鈉；藤倉鐮刀菌最適生長溫度是25。C，最適pH為8，最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是硝酸鈉：擬輪枝鐮刀菌最適生長溫度是25。C，最適pH為8，最佳碳源是蔗糖、葡糖糖、果糖，最佳氮源是硝酸鈉、尿素。3．病原鐮刀菌脂肪酸分析。應(yīng)用Sherlock脂肪酸鑒定系統(tǒng)，總共檢測出36種脂肪酸。SumInFeature3、16：00、SumInFeature5、18：1w9c和18：00為主要脂肪酸。 廣西大掌碩士掌位論文水稻穗腐病錮E刀菌及相關(guān)毒素研究5種鐮刀菌的脂肪酸組成及含量有一定的差異性，但不顯著。因此，無法利用脂肪酸組成特征十分準(zhǔn)確的將不同鐮刀菌進(jìn)行分類。4．病原鐮刀菌致病力。通過病原菌孢子懸浮液接種水稻穗部試驗(yàn)，證明藤倉鐮刀菌的致病力最強(qiáng)，擬輪枝鐮刀菌、層出鐮刀菌、禾谷鐮刀菌次之，尖孢鐮刀菌最弱。5．病原鐮刀菌產(chǎn)毒能力和粗毒素毒性。禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和層出鐮刀菌的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基為Richard培養(yǎng)基，最佳產(chǎn)毒溫度為25℃，最佳產(chǎn)毒pH為6，最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)時(shí)間為15天；藤倉鐮刀菌和擬輪枝鐮刀菌的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基為Richard和PD培養(yǎng)基，最佳產(chǎn)毒溫度為25。C，最佳產(chǎn)毒pH為8，最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)時(shí)間為15天。利用活性炭吸附法提取了各種鐮刀菌的粗毒素，并測試了粗毒素的毒性。藤倉鐮刀菌粗毒素對水稻的毒害作用最強(qiáng)，尖孢鐮刀菌最弱。利用ELLISA技術(shù)測定了粗毒素中伏馬菌素(fumonisin)的含量。其中，藤倉鐮刀菌粗毒素中伏馬菌素含量最高，為5379．03ppm；擬輪枝鐮刀菌次之，含量為638．62ppm：之后是禾谷鐮刀菌禾谷鐮刀菌，含量為139．39ppm；層出鐮刀菌含量為13．87ppm；最后是尖孢鐮刀菌，含量僅為2．16ppm。6．水稻穗腐病田間防治。用20％異噻菌胺懸浮劑(200ga．i．／ha)在分蘗盛期和孕穗末期各噴霧1次的防治效果最好，達(dá)到45．06％。25％咪鮮胺乳油+15％---唑酮乳油(112．25+90ga．i．／ha)孕穗末期和齊穗期各噴霧1次的防治效果并不理想，防效只有27．99％；25％咪鮮胺乳油+50％多菌靈可濕性粉劑(112．5+450ga．i．／ha)孕穗末期和齊穗期各噴霧1次的防治效果最差，防效僅有0．08％。關(guān)鍵詞：水稻穗腐?。荤牭毒?；致病力；生物學(xué)特性；脂肪酸；毒素；防治 廣。西『大學(xué)碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒；素研究StudiesonBiologicalCharacteristicsandToxinofRiceSpikeletRotDisease(asPa))PathogensFusariumspp．AbstractInrecentyears，theregenerallyOccursadiseaseinthericeplantingareaaroundChina，whichseriouslydamagesthepanicleandgrainofrice，andwegenerallycallitthericespikeletrotdisease(RSRD)．Thisdiseaseiscausedbyavarietyoffungi，andcouldcausethespoiling，discoloringanddeformityofricegrains，SOthesettingpercentagemaybereducedanditwillhaveastrongimpactonthericeproduction．Atthesametime，thericegrainsprobablelybedebasedbecauseofthepigmentandtoxinproducedbythepathogenicbacteria．Inthisstudy,infectedricespikeletsampleswerecollectedfromHangzhouandJiaxingcities，Zhejiangprovince，and216strainsofFusariumspp．wereisolated，andidentifiedbymorphologicalandmolecularbiologicalmethods．Theycouldbetotallydividedintofivespecies．Biologicalcharacteristics，fattyacidprofile，toxin．producingability,toxicityofcrudetoxin，andthemanagementoftheRSRDwerealsostudied．Theresultsareasfollows：1．IsolationandidentificationofRSRDpathogenicpathogens．216strainsofFusariumspp．wasisolatedfrominfectedricepaniclesamples．Theywereidentifiedanddividedintofivespecies，suchasEproliferatum．Ffujikuroi,Everticillioidess，Eoxysporum，andEgraminearum．Amongthese216strains，，therewere137strainsofEProliferatum，accountingfor63．4％，50strainswereEfujikuroi。accountingfor23．1％，21strainsbelongtoEverticillioidess，accountingfor9．7％。5strainsofEoxysporum，accountingfor2．3％，andonly3strainsofEgraminearum．a(chǎn)ccountingfor1．4％．ThepathogenicityofallisolatedstrainswasprovedaccordingtoKoch’Spostulates．2．BiologicalcharacteristicsoftheFusariumspecies．TheoptimumconditionofEgraminearumgrowthtemperatureis25。C，pHis6，the；；； 廣西大掌碩士掌位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)．青：素研究bestcarbonsourceisglucoseandsucrose，andthebestnitrogensourceisureaandsodiumnitrate．TheoptimumgrowthtemperatureofEoxysporumis25。C，pHis6，thebestcarbonsourceisglucoseandsucrose，andthebestnitrogensourceissodiumnitrate．TheoptimumgrowthtemperatureofEproliferatumis25*C，pHis6，thebestcarbonsourceissucroseandglucose，andthebestnitrogensourceissodiumnitrateandsodiumnitrite．TheoptimumgrowthtemperatureofFfujikuroiis25*C，pHis8，thebestcarbonsourceisglucose，andthebestnitrogensourceissodiumnitrate．TheoptimumgrowthtemperatureofEverticillioidessis25。C，pHis8，thebestcarbonsourceissucrose，glucoseandfructosesugar,andthebestnitrogensourceissodiumnitrateandurea．3．FattyacidprofileanalysisoftheFusariumspecies．36kindsoffattyacidsoftheisolatedFusariumwereanalyzedbythesherlockfattyacidsidentificationsystem．ThefattyacidsofSumInFeature3，16：00，SumInFeature5，18：1w9cand18：00arethemainfattyacids．ThecellularfattyacidsprofilesofthesefiveFusariumspeciesshoweddifferencesbutnotsignificant，andthedifferencewasnotenoughforFusariumspp．Identification．4．PathogenicityoftheFusariumspecies．ThepathogenicityofEfujikuroiisthestrongest，Everticillioidess,EproliferatumandEgraminearumareatsecondplaceandEoxysporumistheweakest．5．Toxin—producingcapacityoftheFusariumspeciesandtoxicityofthecrudetoxin．Thebesttoxin-producingconditionsforFgraminearum．EoxysporumandEproliferatumweretheRichardmedium，temperatureof25。C，pHof6，andcultivationfor15days．Similarly,forF．fujikuroandEverticillioidess，thebestconditionswereRichardandPDmediums，temperatureof25"C，pHof8，andcultivationfor15days．StudiesontheeffectofcrudetoxinagainstriceseedlingshowedthatthetoxicityofF．fujikurocrudetoxinisthestrongesttorice，andthetoxicityofEoxysporumcrudetoxinistheweakest．ThefumonisincontentinthecrudetoxinofEfujikuroisthehighestwhichreached5379．03ppm(}．tg／g)．Everticillioidess’Stakessecondplace，andthecontentis638．62ppm．Egraminearum’Stakesthirdplace，andthecontentis139．39ppm．InEproliferatum，thecontentis13．87ppm，yetinEoxysporum，thefumonisincontentistheleastanditisonly 廠‘西大掌碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究2．16ppm．6．Preventionandcontrolofthericespikeletrotdiseaseinthefield．Thecontrolefficiencyisthebestandcouldbeupto45．06％，when20％isotianilsuspensionliquidsprayingatimebothinthetilleringstageandbootingstage．Thecontrolefficiencyisnotthatidealandonly27．99％，whenusingboth25％prochlorazand15％triadimefonspayingatimebothinthebootingstageandfullpaniclestage．Thecontrolefficiencyistheworstandonly0．08％，whenusingboth25％prochlorazand50％carbendazoiwettablepowderspayingatimebothinthebootingstageandfullpaniclestage．Keywords：RiceSpikeletRotDisease(RSRD)；Fusarium；Pathogenicity；Biologicalcharacteristic；Thecellularfattyacidsprofile；Fusariumtoxin；ControlofRSRDV 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究目錄1前言?????????????????????????????????11．1水稻后期穗部病害??????????????????????????l1．1．1稻曲病??????????????????????????????．11．1．2稻粒黑粉病????????????????????????????．．21．1．3水稻穎枯病????????????????????????????．21．2鐮刀菌引起的禾谷類作物穗部病害???????????????????31．2．1玉米穗腐病????????????????????????????．31．2．2小麥赤霉病????????????????????????????．31．3水稻穗腐病主要研究進(jìn)展???????????????????????．41．4鐮刀菌毒素研究???????????????????????????51．5本研究的目的與意義?????????????????????????62材料與方法??????????????????????????????72．1病害標(biāo)本采集????????????????????????????．72．2供試水稻品種????????????????????????????72．3培養(yǎng)基???????????????????????????????72．4試劑與藥品?????????????????????????????72．4．1分子鑒定試劑???????????????????????????．72．4．2脂肪酸分析試劑??????????????????????????．82．4．3伏馬菌素檢測試劑?????????????????????????．82．5主要儀器設(shè)備????????????????????????????92．6病原鐮刀菌的分離和鑒定???????????????????????92．6．1病原鐮刀菌的分離、純化??????????????????????．92．6．2病原鐮刀菌致病性測定???????????????????????102．6．3病原鐮刀菌鑒定??????????????????????????102．7病原鐮刀菌的生物學(xué)特性???????????????????????112．7．1溫度對病原鐮刀菌生長的影響????????????????????11 水稻穗腐靖}鐮刀菌及相關(guān)毒素研究2．7．2pH對病原鐮刀菌生長的影響???????????．．OO．．．．．．JOIaIO．．．．．．O0112．7．3不同碳源對病原鐮刀菌生長的影響??????????????????122．7．4不同氮源對病原鐮刀菌生長的影響??????????????????122．8病原鐮刀菌的脂肪酸差異分析????????????????????．．122．8．1菌絲體制備????????????????????????????122．8．2脂肪酸抽提????????????????????????????132．8．3色譜分析?????????????????????????????132．9病原鐮刀菌的致病力研究??????????????????????．．142．10病原鐮刀菌產(chǎn)毒研究探索??????????????????????142．10．1粗毒素制備???????????????????????????．142．10．2最佳產(chǎn)毒條件??????????????????????????．152．10．3粗毒素毒性分析?????????????????????????．162．10．4粗毒素中伏馬菌素檢測??????????????????????．162．1l水稻穗腐病大田防治????????????????????????172．11．1供試藥劑????????????????????????????．172．11．2試驗(yàn)處理????????????????????????????．172．11．3調(diào)查與統(tǒng)計(jì)方法?????????????????????????．173結(jié)果與分析?????????????????????????????．183．1病原鐮刀菌的分離和純化??????????????????????．．183．2病原鐮刀菌鑒定??????????????????????????．．183．2．1形態(tài)學(xué)鑒定????????????????????????????183．2．2分子鑒定?????????????????????????????223．3病原鐮刀菌的生物學(xué)特性??????????????????????一243．3．1溫度對病原鐮刀菌生長的影響????????????????????243．3．2pH對病原鐮刀菌生長的影響????????????????????．．283．3．3不同碳源對病原鐮刀菌生長的影響??????????????????313．3．4不同氮源對病原鐮刀菌生長的影響??????????????????343．4病原鐮刀菌的脂肪酸差異分析探索??????????????????．．363．5病原鐮刀菌的致病力研究??????????????????????．．42 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究3．6病原鐮刀菌產(chǎn)毒研究探索??????????????????????一433．6．1最佳產(chǎn)毒條件???????????????????????????433．6．2粗毒素的毒性分析?????????????????????????473．6．3伏馬菌素檢測???????????????????????????503．7水稻穗腐病的防治?????????????????????????．．524討論與結(jié)論?????????????????????????????．544．1水稻穗腐病侵染源?????????????????????????．．544．2穗腐病鐮刀菌生物學(xué)特性???????????????????????544．3穗腐病鐮刀菌脂肪酸組成分析?????????????????????554．4穗腐病鐮刀菌致病力分析??????????????????????．．564．5穗腐病鐮刀菌產(chǎn)毒探索???????????????????????．．574．6水稻穗腐病的田間防治???????????????????????．．584．7今后研究方向???????????????????????????一58致謝??????????????。???????????????????60參考文獻(xiàn)??????????????????????????????61附錄：????????????????????????????????．67 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究1前言水稻是我國的主要糧食作物，其種植面積約占全國耕地總面積的29％，每年的稻米產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的40％左右。我國是全世界最大的水稻生產(chǎn)和消費(fèi)國之一，全國以大米為主食的人口不低于總?cè)丝诘?0％。因此，在我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中和消費(fèi)，水稻的地位尤為重要(黃發(fā)松，2002：Khushetal，2005)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因水稻病害而造成的產(chǎn)量損失為10％．15％，而水稻后期的穗部病害是導(dǎo)致減產(chǎn)的最直接和最嚴(yán)重的原因之一。其中，水稻穗腐病(Ricespikeletrotdisease，RSRD)是最主要的水稻后期穗部病害，且在全國各稻區(qū)普遍發(fā)生并有逐年上升和加重的趨勢，尤其是長江中下游秈、粳稻混栽稻區(qū)和東北粳稻區(qū)。最初，層出鐮刀菌(Fproliferatum)、澳大利亞平臍蠕孢菌(B．a(chǎn)ustraliensis)、新月彎孢菌(Clunata)和細(xì)交鏈孢菌(彳．tenuis)被定為主要病原菌(劉恩勇，2011)，后經(jīng)本人研究發(fā)現(xiàn)，除了層出鐮刀菌(Fproliferatum)外，其他多種鐮刀菌都可侵染水稻穗部和谷粒，引起水稻穗腐病。1．1水稻后期穗部病害除水稻穗腐病外，水稻后期稻穗病害主要有稻曲病、稻粒黑粉病和水稻穎(谷)枯病。其中水稻穎(谷)枯病可分為真菌性潁(谷)枯病(病原菌為Phomasorghina)和細(xì)菌性穎(谷)枯病(病原菌為Burkholderiaglumae)。1．1．1稻曲病稻曲病是水稻在生長后期穗部發(fā)生的一種病害(黃世文等，2002)，其病原菌為稻綠核菌(Ustilasinoideavirens)(Rushetal，2000)。該病病原菌侵染稻穗谷粒，感病谷粒被菌絲塊包裹，大小為正常谷粒的3．4倍，初期為橙黃色，表面平滑，后期變?yōu)槟G色，表面粗糙龜裂，內(nèi)布滿黑色粉狀物。感病稻穗通常每穗1．5個(gè)病粒，嚴(yán)重時(shí)可多達(dá)數(shù)十粒，且田間病穗率超過10％(OUetal，1985)。稻綠核菌(Uvirens)主要以菌核形式在土壤中越冬，也可以厚垣孢子形式在感病谷粒內(nèi)或健康谷粒穎殼上越冬。當(dāng)菌核或厚垣孢子遇到合適的條件時(shí)，便可萌發(fā)行成子囊孢子和分生孢子，并在水稻揚(yáng)花期侵染水稻花器和穎殼(賴傳雅，2003)。防治稻曲病可用2％福爾馬林、0．5％硫酸銅浸種或于水稻抽穗前用18％多菌酮粉劑、14％絡(luò)氨銅水劑、5％井岡霉素水劑噴霧也能達(dá)到較好的防治效果(朱文達(dá)等，1996；左輝仕等，2005)。 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究1．1．2稻粒黑粉病稻粒黑粉病的病原菌為狼尾草腥黑粉菌(7illet&barclayana)(方羽生等，2004)，該病原菌主要在水稻揚(yáng)花期至灌漿期侵染水稻，初侵染時(shí)期癥狀不明顯，至水稻黃熟時(shí)癥狀才容易識(shí)別(左震東，1990)。病原菌首先侵染水稻花柱，隨后侵染子房和花器組織，病原菌菌絲緊貼谷粒糊粉層細(xì)胞或于糊粉層細(xì)胞之間生長蔓延，致使谷粒產(chǎn)生瘤狀突起，并逐漸膨大呈球形或橢圓形。發(fā)病初期病粒表面呈污黃色或污綠色，后期病粒在穎殼縫隙形成黑色的舌狀突起物或沿腹部開裂，并產(chǎn)生大量黑粉(陳毓苓等，1992；劉慧，2008)。感病稻穗通常每穗1．10粒病谷，嚴(yán)重時(shí)可多達(dá)數(shù)十粒。病原菌主要以冬孢子的形式粘附在種子和病株殘?bào)w上或于田間土壤中越冬，存活時(shí)間可長達(dá)一年甚至更久(黃富，1992)。防治稻粒黑粉病的藥劑主要有50％多菌靈粉劑、15％三唑酮乳油(劉命朔等，1994)，可在水稻抽穗揚(yáng)花期噴霧防治(范西玉，1986：劉慧，2008)。1．1．3水稻穎(谷)枯病水稻穎(谷)枯病分為真菌性穎(谷)枯病和細(xì)菌性穎(谷)枯病，其病原菌分別為谷枯葉點(diǎn)霉菌(戶sorghina)和穎殼伯克氏菌(B．glumae)(歐壯赫等，1999)。真菌性穎(谷)枯病病菌主要以分生孢子器的形式在染病谷粒上越冬(王國珍等，2007)，當(dāng)條件適宜時(shí)，便以分生孢子為初侵染源，于水稻抽穗．楊花期侵染水稻谷粒的穎殼和花器，從而導(dǎo)致谷粒染病(王昌家等，2006)。若水稻抽穗．揚(yáng)花期遇到強(qiáng)風(fēng)暴雨天氣，致使稻穗之間互相摩擦產(chǎn)生更多機(jī)械損傷，更有利于病原菌侵染，從而導(dǎo)致病害程度加重(OU，1981)：若偏施或過施氮肥，會(huì)延遲水稻成熟，同樣也將增加病原菌侵染機(jī)率；還有在倒伏的田塊，由于地面溫濕度較高，也會(huì)提高病原菌侵染機(jī)率，導(dǎo)致病害程度加深(肖慶璞，1995：歐壯掂等，1999)。細(xì)菌性的穎(谷)枯病的染病谷粒初期出現(xiàn)白色萎蔫，類似缺水癥狀，并逐漸變?yōu)榛野咨驕\褐色，谷粒穎殼頂端或基部變?yōu)樽虾稚?Miyagawaetal，1998；『Shahjahanetal，2002)，后期感病谷粒表面有乳白色菌膿溢出，并伴隨有難聞的臭味(Haetal，1993；謝關(guān)林等，2003)。若水稻前期染病，則莖部常伴有較短的倒生根，且病株一般在抽穗前枯死，少數(shù)能抽穗的病株稻穗畸形、谷粒不實(shí)(簡錦忠，1983：Miyagawaetal，1998；徐麗慧，2008)。防治藥劑可參照穗頸瘟(張晚興等，1999)，也可用30％氧氯化銅懸浮劑或77％可殺得懸浮劑于始穗期和齊穗期各噴藥一次，必要時(shí)也可在灌漿．乳熟期加噴一次，' 廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究可以達(dá)到較好的防治效果(王玉坤，1999：劉金波等，2005)。1．2鐮刀菌引起的禾谷類作物穗部病害鐮刀菌屬(Fusarium)為半知菌亞門(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、瘤座菌目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)真菌，因其大型分生孢子多數(shù)呈鐮刀狀而得名(戴芳瀾，1979；魏景超，1979；謝聯(lián)輝，2006)。鐮刀菌可侵染多種農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)作物，且地理分布十分廣泛，并在土壤和植物體內(nèi)普遍存在(張向民等，2005)。據(jù)研究，有20多種鐮刀菌可侵染禾谷類作物，主要有：禾谷鐮刀菌(Fgraminearum)、黃色鐮刀菌(Fculmorum)、雪腐鐮刀菌(Fnivale)、燕麥鐮刀菌(Favenaceum)等(Parryetal，1995；Miedaneretal，1997)。鐮刀菌可引起的禾谷類作物穗部病害主要有：玉米穗腐病、小麥赤霉病和水稻穗腐病等。1．2．1玉米穗腐病玉米穗腐病是多種病原菌引起的病害(馬秉元等，1998；陳捷，2000)，其病原鐮刀菌主要有玉蜀黍赤霉菌(Gibberella2eae)、串珠赤霉菌(Gmoniliformis)、層出鐮刀菌(Fproliferatum)和木賊鐮刀菌(Fequiseti)等(盧維宏等，2010，201l；裴冬麗等，2011)。病原菌可侵染玉米果穗和籽粒引起玉米穗腐病。染病果穗頂部或中部變色，病原菌的菌絲體、分生孢子梗和分生孢子附著并覆蓋其上，形成黑灰色、粉紅色、黃褐色或暗褐色霉層(Logriecoetal，1995；李洪連等，1999)；染病籽粒不飽滿，無光澤，質(zhì)地較脆，內(nèi)部多空虛并被菌絲體充塞；染病果穗病部苞葉多被密集的菌絲體貫穿而粘結(jié)于一起，并緊貼于果穗上，不易剝離(孔令曉等，1995)。倉儲(chǔ)玉米被侵染后，糧堆內(nèi)外長出顏色不同、疏密不均的菌絲體和分生孢子，并能聞到發(fā)霉的氣味(李小平等，2007)。主要防治措施有：選擇適當(dāng)播種時(shí)期，避開病害高發(fā)期；合理密植，避免局部濕度較大；科學(xué)施肥，促進(jìn)玉米早熟，提高抵抗力；結(jié)合蟲害防治，降低傷口感染的機(jī)率。藥劑防治可選用50％多菌靈可濕性粉劑或50％甲基硫菌靈可濕性粉劑，拌種或抽穗期至發(fā)病初噴灑均有較好的防治效果(宋偉彬等，2005)。1．2．2小麥赤霉病小麥赤霉病的主要病原菌為禾谷鐮刀菌(Egraminearum)(Parryetal，1995；Miedaneretal，1997：喻璋，2002)。小麥幼苗至抽穗期均可感染赤霉病，引起苗枯、莖腐和穗腐等。染病小麥幼苗芽鞘和根鞘出現(xiàn)黃褐色水浸狀病斑并逐漸腐爛，嚴(yán)重時(shí)整株幼苗枯死，后期病部長有粉紅色霉層。小麥莖部病變主要發(fā)生在基部，初期呈褐 廣西大掌碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究色，隨后變軟腐爛，植株萎蔫甚至枯死，后期病部長有粉紅色霉層(Miedaneretal，1997)。病菌侵染小麥穗部時(shí)，最初在小穗穎殼上出現(xiàn)灰褐色水浸狀病斑，后逐漸擴(kuò)大至整個(gè)麥穗，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)麥穗枯死。若氣候濕潤，染病部位會(huì)長出粉紅色膠狀霉層，后期長出黑色小顆粒狀子囊殼(喻璋，2002；侯明生等，2006)。赤霉病在全國麥區(qū)均有發(fā)生，長江中、下游冬麥區(qū)發(fā)病最為嚴(yán)重(喻璋，2002)。近年來，赤霉病在華北麥區(qū)的發(fā)生和危害有上升和加重的趨勢，病害嚴(yán)重年份發(fā)病率高達(dá)50％．100％，造成10％．40％的產(chǎn)量損失。病原菌主要以菌絲體形式潛伏在小麥、高粱、玉米、豆類、芝麻、油菜、棉、麻及田間雜草殘?bào)w或小麥種子內(nèi)越冬。赤霉病的發(fā)生、流行與氣候變化關(guān)系密切，若在小麥抽穗．揚(yáng)花期至灌漿期遭遇連續(xù)陰雨天氣，將大幅增加赤霉病發(fā)生機(jī)率。另外，若麥田地勢低洼、土壤粘滯和排水不暢等引起濕度過高，也將利于病害的發(fā)生。藥劑防治可選50％多菌靈可濕性粉劑、50％甲基硫菌靈可濕性粉劑和60％1甲霉靈可濕性粉劑等，拌種或于揚(yáng)花期噴霧均有較好的防治效果(侯明生，2001)。1．3水稻穗腐病主要研究進(jìn)展近年來，隨著耕種制度和栽培措施的改變以及氣候變暖的影響，大穗型粳稻和秈／粳雜交稻品種(組合)大面積推廣種植，導(dǎo)致水稻穗腐病(RSRD)的發(fā)生及危害逐年加重，特別是長江中下游秈、粳稻混栽稻區(qū)和東北粳稻區(qū)。該病由多種真菌引起，造成稻米腐壞、變色、畸形，結(jié)實(shí)率降低或不實(shí)，引起水稻減產(chǎn)；由于病原菌本身帶有顏色，進(jìn)而影響稻米外觀，降低稻米品質(zhì)；病原菌可產(chǎn)生毒素，對食用者的安全和健康構(gòu)成嚴(yán)重危害(Huangetal，2011；劉恩勇，201l；侯恩慶等，2013)。水稻穗腐病癥狀為：稻穗染病初期，谷粒穎殼產(chǎn)生黃褐色或鐵銹色橢圓形小斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大并變?yōu)楹稚螯S褐色直至黑褐色，致使米?；危行┌橛邪咨蚍凵箤?。發(fā)病較早且較嚴(yán)重的稻穗不能結(jié)實(shí)，發(fā)病遲的則影響谷粒灌漿，導(dǎo)致秕粒增多，千粒重降低。過去穗腐病在各稻區(qū)多為零星發(fā)生，對水稻生產(chǎn)影響并不嚴(yán)重，因此未引起足夠重視，少有對該病的系統(tǒng)研究，病害發(fā)生和危害情況不夠明確，防治方法和防治藥劑也不確定。自2006年起，本研究室對水稻穗腐病進(jìn)行了數(shù)年的調(diào)查和研究。目前，全國有80萬hm2水稻穗腐病常年發(fā)生田和1000萬hm2輕度發(fā)生田，占全國水稻種植面積的1／3左右。若氣候條件以及栽培措施等適宜病害發(fā)生，則會(huì)造成十分嚴(yán)重的危害(劉恩勇，2011；侯恩慶等，2013)。 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究本實(shí)驗(yàn)室對水稻穗腐病的發(fā)生和流行原因進(jìn)行了分析，并分離、鑒定了病原菌并檢驗(yàn)了致病性，篩選了殺菌劑防治該病并進(jìn)行了田間藥效試驗(yàn)。結(jié)果表明，緊穗型的粳稻和秈／粳雜交稻品種(組合)比松散穗型的秈稻及其雜交品種(組合)更容易感??；水稻孕穗后期至抽穗．揚(yáng)花期遇連續(xù)陰雨、高濕和溫暖的天氣會(huì)大大增加穗腐病的發(fā)生和危害；從水稻感病稻穗上分離到層出鐮刀菌(Fproliferatum)、澳大利亞平臍蠕孢菌(B．a(chǎn)ustraliensis)、新月彎孢菌(Clunata)和細(xì)交鏈孢菌(彳．tenuis)4中病菌，用分離到的4個(gè)菌根據(jù)Koch法則進(jìn)行人工接種，4個(gè)菌均能使稻粒感病，并初步確定層出鐮刀菌為穗腐病主要初侵染源(Huangetal，2011)；室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度5ppm以上的50％多菌靈可濕性粉劑、45％咪鮮胺乳油和30％苯醚甲環(huán)唑·丙環(huán)唑乳油(愛苗)對層出鐮刀菌(Fproliferatum)生長的抑制效果較好，可達(dá)81．31％．100％，抑制中濃度為0．0007．0．9476ppm；田間藥效試驗(yàn)結(jié)果顯示，選用20％三唑酮乳油、50％多菌靈可濕性粉劑或70％甲基托布津可濕性粉劑，在水稻孕穗后期和抽穗．揚(yáng)花期各噴霧一次，防治效果在65％左右(劉恩勇，2011；黃世文等，2012)。1．4鐮刀菌毒素研究鐮刀菌引起的禾谷類農(nóng)作物的穗腐病、赤霉病可產(chǎn)生毒素污染谷物籽粒(D’Melloetal，1997；陳石等，2011)。鐮刀菌產(chǎn)生的毒素主要有伏馬菌素(fumonisin)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等(D’Melloetal，1999；陳石等，2011)。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)為一種致嘔吐物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)為雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，NIV)的4．脫氧衍生物，又被稱為嘔吐毒素(Vomitoxin，VT)(胡南等，1997)。DON的耐藏力很強(qiáng)，具有較強(qiáng)的耐熱性力和耐酸性，可長期保存于乙酸乙酯中，高壓和堿處理可破壞其部分毒性(史建榮等，1997)。主要產(chǎn)毒菌為禾谷鐮刀菌(Fgraminearum)和粉紅鐮刀菌(Froseum)等。DON具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，會(huì)導(dǎo)致人、畜反應(yīng)遲鈍、厭食、腹瀉、嘔吐、發(fā)燒等急性中毒癥狀，也可影響免疫系統(tǒng)，中毒嚴(yán)重時(shí)可造成造血系統(tǒng)損害甚至死亡(裴自友等，2008；于洪寶等，2009)。伏馬菌素(fumonisin)是一類由丙三羥酸和多氫醇組成的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的雙酯化合物，耐熱程度較強(qiáng)(D’Melloetal，1999；Jinetal，2007；吳劍威等，2008)。其主要產(chǎn)毒菌為串珠鐮刀菌(Fmoniliforme)(Kelleretal，1997)。目前發(fā)現(xiàn)的伏馬菌素共 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究有11種，F(xiàn)A類2種、FB類4種、FC類4種FP類1種，其中FBI為主要種類(Kosteckietal，1999；Marinetal，1999；于洪寶等，2009)。伏馬菌素(fumonisin)是一種致癌物(左春生，2006；Haoetal，2008)，主要損害肝、。腎功能(Lionetal，2006；Renetal，2007)，能導(dǎo)致豬肺水腫和馬腦白質(zhì)軟化等癥(Marinetal，1999；Wangetal，2002)，也可引起動(dòng)物食道癌，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重威脅(Jiangetal，1998；肖前青等，2008：Cuietal，2006)。玉米赤霉烯酮(ZEN)因從有感染赤霉病的玉米中分離得到而得名，又被稱作F．2毒素，具有較強(qiáng)的耐熱性，在110℃條件下處理lh才能完全破壞其毒性(史文琦等，2011)。ZEN的產(chǎn)毒菌主要是禾谷鐮刀菌(Fgraminearum)、三線鐮刀菌(Ftrichwtum)等。ZEN主要污染小麥、大麥、玉米、大米、小米、燕麥等谷物(于洪寶等，2009)。ZEN具有雌激素作用，能對動(dòng)物的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生危害，造成動(dòng)物急、慢性中毒，導(dǎo)致動(dòng)物繁殖機(jī)能紊亂甚至死亡，也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒，并發(fā)神智抑郁、共濟(jì)失調(diào)、惡心、頭痛等癥狀，給人和動(dòng)物造成重大損害(肖前青等，2008)。1．5本研究的目的與意義水稻穗腐病不但影響水稻產(chǎn)量，而且降低稻米的品質(zhì)。對水稻的生產(chǎn)和稻米市場價(jià)格造成嚴(yán)重影響。同時(shí)對人、畜、禽的健康和安全構(gòu)成嚴(yán)重危害(黃世文等，2011)。發(fā)現(xiàn)水稻后期穗部谷粒變色及霉點(diǎn)的現(xiàn)象以由來己久，且近年來越來越嚴(yán)重，對水稻生產(chǎn)已經(jīng)造成極大的危害。2008年前，穗腐病在全國各地均是零星發(fā)生，對水稻生產(chǎn)的危害不大。2008年、2009年該病在浙江、安徽、江蘇、黑龍江等地部分品種(組合)上發(fā)生較為嚴(yán)重，并嚴(yán)重影響了水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)。本研究的目的為確定侵染水稻穗部的鐮刀菌種類，明確其致病力和生物學(xué)特性，為致病機(jī)理、病害發(fā)生規(guī)律的研究打下基礎(chǔ)，有助于科學(xué)指導(dǎo)病害防治工作；對各鐮刀菌的產(chǎn)毒條件和能力進(jìn)行探索，并檢測粗毒素中伏馬菌素的含量，防止人畜等受其危害；篩選出效果較好的防治藥劑，提出相應(yīng)的防控策略，為制定有效防控穗腐病的措施奠定基礎(chǔ)。本研究對水稻穗腐病基礎(chǔ)理論研究具有重要的推進(jìn)作用。 水稻穗腐扁-m．72菌及相關(guān)毒素研究2材料與方法2．1病害標(biāo)本采集取浙江省杭州市中國水稻研究所富陽試驗(yàn)基地A．D區(qū)和浙江省嘉興市植保站試驗(yàn)田田間感病稻穗，并低溫真空保存。供采樣的水稻品種主要有“秀水09”(粳稻)、“甬優(yōu)”和“春優(yōu)”系列(秈粳雜交稻)、“國稻6號(hào)”(超級(jí)雜交稻)等品種(組合)。2．2供試水稻品種供試水稻品種為粳型常規(guī)稻“秀水09”(實(shí)驗(yàn)室自備，較感穗腐病品種)和秈型雜交稻“中浙優(yōu)1號(hào)"(浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司，較抗穗腐病品種)2．3培養(yǎng)基水瓊脂培養(yǎng)基(WA)：蒸餾水1000mL，瓊脂粉20g，高溫高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后使用。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：蒸餾水1000mL、馬鈴薯200g、瓊脂粉20臥葡萄糖20g，高溫高壓滅菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后使用。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)：蒸餾水1000mL、馬鈴薯200g、葡萄糖20g，高溫高壓滅菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后使用。Czapek培養(yǎng)基：蒸餾水1000mL、蔗糖30g、NaN032g、K2HP041g、KCIO．5g、MgS04·7H20O．5g、FeS040．01g，若制備固體培養(yǎng)基則加20g瓊脂，高溫高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后使用。TSBA培養(yǎng)基：蒸餾水1000mL、胰蛋白大豆肉湯(TSB)30g、瓊脂15g，高溫高壓滅菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后使用。馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(PSB)：蒸餾水1000mL、馬鈴薯200g、蔗糖20g，高溫高壓滅菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后使用。Richard培養(yǎng)基：蒸餾水1000mL、蔗糖50昏KN0310昏KH2P045臥MgS04·7H202．5g、GZ2(S04)30．02g，高溫高壓滅菌(121℃，2．4x105Pa，20rain)后使用。2．4試劑與藥品2．4．1分子鑒定試劑CTAB提取液：含O．7mol／LNaCI、20mmol／LEDTA、2．O％CTAB、0．1％D．巰基7 廣西大掌碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究乙醇、100mmol／LTris．HCI(pH8．0)(蔣盛巖等，2002)。配制方法為稱取CTAB2．0g，加蒸餾水40mL，加1．0MTris—HCI(pH8．0)10mL、0．5MEDTA4mL和5．0MNaCI14mL，待CTAB完全溶解后，用蒸餾水定容至100mL，高溫高壓滅菌(121℃，2．4x105Pa，20rain)后加入0．1mL的B．巰基乙醇。氯仿／異戊醇混合液：按體積比24：1配制，即240mL氯仿中加入10mL異戊醇。CTAB沉淀液：含50mmol／LTris．HCl(pH8．0)、10mmol／LEDTA、1．0％CTAB。配制方法為稱取EDTA1．0g，加蒸餾水20mL，加1．0MTris．HCI(pH8．0)5mL，O．5MEDTA2mL，待CTAB完全溶解后，用蒸餾水定容至100mL，高溫高壓滅菌(12l℃，2．4×10’Pa，20rain)后使用。2×TaqPCRGreenMix．"組分包含O．1U／pLTaqDNAPolymerase、2×反應(yīng)緩沖液、3mMMgCl2、0．4mMdNTPs、指示劑，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。PCR引物：efl(正向引物，5’．ATGGGTAAGGARGACAAGAC．3’)和e12(反向引物，5’．GGARGTACCAGTSATCATGTT．3’)由杭州博尚生物有限公司合成。其他試劑：DNAMarkerDL2000由上海萊楓生物科技有限公司生產(chǎn)，DNA回收試劑盒、pMD．18T載體試劑盒由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)。大腸桿菌(E．coli)DH5Gt感受態(tài)參照薩姆布魯克等(2002)的文獻(xiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法制備。2．4．2脂肪酸分析試劑試劑1(造化試劑)：NaOH(色譜純)45g、甲醇(色譜純)150mL、ddH20150mL，高溫高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，20rain)后使用。試劑2(甲基化試劑)：6．0NHCI(色譜純)325mL、甲醇(色譜純)275mL，高溫高壓滅菌(121℃，2．4x10’Pa，20rain)后使用。試劑3(萃取溶劑)：己烷(色譜純)200mL、甲基叔丁基醚(色譜純)200mL，高溫高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，20rain)后使用。試劑4(洗滌溶劑)：NaOH(色譜純)10．8g、ddH20900mL，高溫高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后使用。試劑5(飽和NaCI溶液)：NaCI(色譜純)40g、ddH20100mL，高溫高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后使用。2．4．3伏馬菌素檢測試劑伏馬菌素高靈敏檢測試劑盒RIDASCREEN⑩fumonisin(R3401)購于德國R-Biopharm公司。R 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究2．5主要儀器設(shè)備超低溫冰箱：DW．86L386，青島海爾特種電器有限公司。超凈工作臺(tái)：SW-CJ．2FB，蘇州凈化設(shè)備有限公司。超聲波清洗器：KQ．250DV，昆山市超聲儀器有限公司。電熱干燥箱：DHG．9070A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。電泳儀：DYY-7C，北京市六一儀器廠。電子天平：BS224S，德國Sartorius公司；PL3002，梅特勒．托利多儀器(上海)有限公司。高速冷凍離心機(jī)：3K15，德國Sigma公司。高壓滅菌鍋：MLS．378，日本Sanyo公司。恒溫混勻儀：MSC．100，杭州奧盛儀器有限公司。恒溫水浴鍋：ST-3D，新西蘭Seedtech公司。恒溫?fù)u床：HYG．A，太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；THZ．C，太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；THZ．C．1，太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。酶標(biāo)儀：InfiniteM200PRO，瑞士Tecan公司。凝膠成像系統(tǒng)：FR．200A，上海復(fù)日科技有限公司。PCR擴(kuò)增儀：EDC．810，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。pH計(jì)：PB．10，德國Sartorius公司。氣相色譜儀：7890A，安捷倫科技(中國)有限公司。人工氣候培養(yǎng)箱：ZRX．300ESW，杭州錢江儀器設(shè)備有限公司。顯微鏡：DM1000，德國Leica公司；CX31，日本Olympus公司；SZ61，日本Olympus公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE．52B，上海亞榮生化儀器廠。制冰機(jī)：XB70，美國Grant公司。自動(dòng)洗板機(jī)：WD．2103A，北京市六一儀器廠。2．6病原鐮刀菌的分離和鑒定2．6．1病原鐮刀菌的分離、純化在超凈工作臺(tái)中，將發(fā)病稻谷用清水沖洗干凈進(jìn)行表面消毒(70％酒精消毒4-6S，O．1％HgCl2消毒2min)，之后用無菌水沖洗2．3遍，用滅菌的濾紙將水分吸干。將表 水稻穗腐病鐮．Tj菌及相關(guān)毒素研究面消毒處理的谷粒穎殼病健交界處切開(方中達(dá)，1998)，放在WA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)。每個(gè)樣本3次重復(fù)，用健康的谷粒作為對照。菌落形成后，挑取菌落邊緣菌絲體，轉(zhuǎn)接于PDA平板上進(jìn)一步培養(yǎng)，經(jīng)過單孢子分離純化后，獲得純化鐮刀菌株，保存?zhèn)溆?劉恩勇，2011)。2．6．2病原鐮刀菌致病性測定分別將分離純化得到的病原菌株制備成1×105mL。孢子懸浮液。在水稻開花當(dāng)天進(jìn)行人工噴霧接種，每穗噴霧5mL孢子懸浮液，接種穗套袋，以噴霧清水的稻穗作為對照，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。接種7d后調(diào)查發(fā)病情況。致病性試驗(yàn)在溫室進(jìn)行，供試水稻品種為“秀水09”(較感品種)。取接種發(fā)病谷粒，按2．6．1所述方法再分離和純化病原菌，獲得再分離菌株，并確認(rèn)在相同的培養(yǎng)條件下(PDA、25℃、7d)再分離菌株與原接種菌株的形態(tài)相同。2．6．3病原鐮刀菌鑒定2．6．3．1形態(tài)學(xué)鑒定將純化菌株在PDA平板上25。C恒溫培養(yǎng)7d，觀察菌株的菌落形態(tài)、質(zhì)地、色澤，顯微鏡下觀察菌株的分生孢子形態(tài)，隨機(jī)測量50個(gè)孢子大小，并與文獻(xiàn)進(jìn)行對比。2．6．3．2分子鑒定獲得菌絲體：將純化的供試菌株在PDA平板上25℃培養(yǎng)3d，用滅菌的打孔器切取菌落邊緣5mm直徑的菌餅，轉(zhuǎn)接到裝有100mLPDB的三角瓶中，恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)(25。C、120r／min)2．3d。用抽濾瓶濾出菌絲體，然后用滅菌的濾紙將菌絲體中的水分吸干，轉(zhuǎn)入滅菌的2mL離心管中保存?zhèn)溆?。CTAB法提取菌絲總DNA：(1)取0．29菌絲于研缽中，用液氮充分研磨菌絲，分裝于滅菌的離心管中；(2)加800gLCTAB提取液，在恒溫水浴鍋中65。C水浴30min，10000r／min離心10min；(3)移取上清液至新的離心管中，加入等體積的氯仿／異戊醇混合液，充分搖勻，10000r／min離心10min；(4)重復(fù)步驟(3)；(5)移取上清液至新的離心管中，加等體積的CTAB沉淀液，充分混勻，10000r／min離心10min；(6)棄上清液，加300gL的1．0mol／LNaCI溶液，使沉淀重新溶解；(7)加等體積的氯仿／異戊醇混合液，充分搖勻，靜置10min使沉淀完全溶解，10000r／min離心10min；(8)移取上清液，加2．5倍體積的冰凍無水乙醇，產(chǎn)生絮狀沉淀物，10000r／min離心10rain：(9)棄上清液，用70％酒精洗沉淀物2．3次，晾干，加60此ddH201n 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究溶解沉淀；(10)取5此DNA溶液，1％瓊脂糖凝膠電泳30min檢測DNA純度，剩余樣品．20℃保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)錄延伸因子(Transcriptionalelongationfactor，TEF)序列PCR擴(kuò)增：用引物efl(正向引物，5’．ATGGGTAAGGARGACAAGAC．3’)和ef2(反向引物，5’．GGARGTACCAGTSATCATGTT．3’)擴(kuò)增供試菌株的TEF片段(Geiseretal，2004)。擴(kuò)增體系：引物efllpL、引物ef2l兒、DNA模板llaL、2xTaqPCRGreenMix10此、ddH207肚，總體積為20此。擴(kuò)增程序：94。C預(yù)變性3min，94。C變性30S，53*C退火30S，72℃延伸50S，共35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。取5此PCR產(chǎn)物，以DNAMarkerDL2000為標(biāo)準(zhǔn)，用1％瓊脂糖凝膠電泳30min，待電泳結(jié)束，拍照記錄結(jié)果(王曉英等，2005：Geiseretal，2004)。TEF序列分析：將PCR產(chǎn)物電泳的目的片段回收純化，用pMD．18T載體鏈接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E．coli)DH5a菌株上，篩選出含目的片段的大腸桿菌(E．coli)DH5a菌株進(jìn)行培養(yǎng)(薩姆布魯克J．，2002)，將菌液送至杭州博尚生物有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過BLAST(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov)與GenBank中的核苷酸序列進(jìn)行分析，用MEGA4．0軟件將供試菌株序列與同供試菌株序列相似的菌株序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。2．7病原鐮刀菌的生物學(xué)特性2．7．1溫度對病原鐮刀菌生長的影響將5mm的病原菌菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)接入PDA平板正中央，分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。5d后測量菌落直徑，采用十字交叉法，兩次測量計(jì)算平均值即為菌落直徑長度(劉恩勇，2011)o2．7．2pH對病原鐮刀菌生長的影響每個(gè)三角瓶中裝100mLPDB培養(yǎng)基，高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后，將PDB培養(yǎng)基pH分別調(diào)至4、5、6、7、8、9、10、l1，將5mm病原菌菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)接入調(diào)好pH的PDB培養(yǎng)基中，25。C恒溫靜置培養(yǎng)5d，將PDB培養(yǎng)基濾去，60℃、12h烘干菌絲體，稱量菌絲體干重(盧維宏，2011)，每個(gè)處理3次重復(fù)。 水稻穗腐病-m．72菌及相關(guān)毒素研究2．7．3不同碳源對病原鐮刀菌生長的影響以Czapek固體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，分別加入淀粉、果糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖7種不同的碳源，以代替Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖，制成7種不同碳源的培養(yǎng)基(劉恩勇，2011)。將病原菌的菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)分別接入不同碳源培養(yǎng)基制成的平板中央，25。C培養(yǎng)5d，觀察記錄菌株生長狀況及菌絲豐度(王洪臣，1997)，測量菌落直徑(方法同2．7．1)，以不加碳源的平板為對照，每個(gè)處理3次重復(fù)。表2．1氣生菌絲豐度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(王洪臣，1997)Table2．1Classificationstandardforrichnessofaerialmycelium等級(jí)Classification氣生菌絲生長狀況Thegrowthmorphologyofaerialmycelium第0級(jí)第A級(jí)第B級(jí)第C級(jí)第D級(jí)第E級(jí)第F級(jí)沒有；所有絮體上都未發(fā)現(xiàn)絲狀菌很少：個(gè)別絮體上發(fā)現(xiàn)絲狀菌一些：不是每個(gè)絮體上都有絲狀菌一般；每個(gè)絮體上都有菌絲l到5根，密度較低較多：每個(gè)絮體上都有菌絲5到20根，中等密度豐富；每個(gè)絮體上都有菌絲超過20根，密度很高大量：大量菌絲形成絲網(wǎng)2．7．4不同氮源對病原鐮刀菌生長的影響以Czapek固體培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，分別加入硫酸銨、尿素、脯氨酸、天門冬素、硝酸鈉、亞硝酸鈉、組氨酸7種不同的氮源以代替Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鈉，制成7種不同氮源的培養(yǎng)基(劉恩勇，2011)。將病原菌的菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)分別接入不同氮源培養(yǎng)基制成的平板中央，25℃培養(yǎng)5d，觀察記錄菌株生長狀況，測量菌落直徑(方法同2．7．1)，以不加氮源的平板為對照，每個(gè)處理3次重復(fù)。2．8病原鐮刀菌的脂肪酸差異分析2．8．1菌絲體制備將高溫高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，20min)的玻璃紙平鋪在TSBA(或PDA)平板上，接5mm的病原菌菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)到玻璃紙上，25℃培養(yǎng)7d，將菌絲體刮下，．20℃保存?zhèn)溆谩?廣西大掌碩士掌位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究2．8．2脂肪酸抽提皂化：(1)將0．2g菌絲體研磨加入特氟榮(Teflon-lined)試管中；(2)加1．0mL試劑1加入試管中，蓋上蓋子密封，漩渦震蕩5min：(3)100。C沸水浴5min，漩渦震蕩5min，(4)100"(2沸水浴25min，冷卻至室溫。甲基化：(1)加入2．0mL試劑2到試管中，蓋上蓋子密封，漩渦震蕩5min；(2)80"(2水浴加熱10min；(3)快速冷水冷卻，變冷卻邊搖晃。萃?。?1)加入1．25mL試劑3到試管中，蓋上蓋子密封；(2)放置旋轉(zhuǎn)器上溫和旋轉(zhuǎn)10min；(3)打開蓋子，用干凈的玻璃管去除樣品下半部的親水部分。堿液洗滌：(1)加入3．0mL試劑4到試管中，蓋上蓋子密封；(2)放置旋轉(zhuǎn)器上溫和旋轉(zhuǎn)5min；(3)加試劑5到試管中，靜置分層；(4)利用干凈的玻璃管吸取上層透明溶液的2／3加入到Agilent小瓶中(SherlockMicrobialIdentificationSystem，2002)。2．8．3色譜分析將抽提得的脂肪酸溶液進(jìn)行氣相色譜(GC)分析，通過MIDI系統(tǒng)的脂肪酸分析軟件SherlockMIS6．0(microbialidentificationsystem)在如下色譜條件下分析脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣品：起始柱溫為170℃，每分鐘5℃提升至260℃，隨后每分鐘40*(2提升至310"(2，持續(xù)90s；汽化室溫度為250℃，檢測器(Detector)溫度為300℃：載氣為氫氣(H22mL·min。1)，尾吹氣為氮?dú)?N230mL·min。)；柱前壓為lOpsi(68．95kPa)；進(jìn)樣量為10此，進(jìn)樣分流比為100：1(SherlockMicrobialIdentificationSystem，2002；劉國紅等，2012)。操作步驟如下：(1)打開H2、N2、空氣鋼瓶的氣閥，并調(diào)節(jié)分壓閥，使H2和N2示數(shù)為O．35左右，空氣的示數(shù)為0．42左右。(2)開啟儀器氣相色譜儀電源，開啟電腦。(3)將標(biāo)準(zhǔn)品和脂肪酸樣品放置到儀器樣盤中。(4)打開sherlocksampleprocessor，編輯樣品信息，選擇方法，status項(xiàng)選擇為Queued，等待編輯結(jié)束后鎖上編輯的表格(LackTable)，避免誤操作。(5)確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)品放在樣品盤的第一個(gè)位置，樣品順序跟表格一致，洗液(正己烷)己放好(在A位)，液面在2／3以上，廢液瓶為空(在W位)。(6)startbathch，軟件自動(dòng)調(diào)用GC軟件，開始進(jìn)樣。l3 廣西大掌碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究(7)最小化記錄窗口，通過窗口instrumentlonline觀看一起參數(shù)(View?onlinesignals?signalwindow1)。(8)全部樣品結(jié)束后，關(guān)閉sherlocksampleprocessor程序，打開Instrumentlonline程序，設(shè)置如下關(guān)機(jī)參數(shù)：1)進(jìn)樣口(Inlet)：關(guān)掉加熱(Heater)，點(diǎn)擊apply，此處切記不可關(guān)閉氣流參數(shù)(Pressure和TotalFlow)；2)爐溫(Oven)：設(shè)置至40。C，點(diǎn)擊apply；3)檢測口(Detector)：關(guān)掉加熱(Heater)和火焰(Flame)，點(diǎn)擊apply。(9)待進(jìn)樣口(Inlet)溫度降至100℃以下，爐溫(Oven)降至40℃，檢測器(Detector)溫度降至100攝氏度以下，關(guān)閉程序InstrumentIonline，關(guān)閉儀器(GC)。(10)關(guān)閉電腦，關(guān)閉氣體(H2最后關(guān))，關(guān)閉總閥(SherlockMicrobialIdentificationSystem，2002)。2．9病原鐮刀菌的致病力研究水稻孕穗后期進(jìn)行套袋處理，在抽穗．揚(yáng)花期采用人工噴霧接種的方法對稻穗進(jìn)行接種(方法同2．6．2)，7d后調(diào)查每穗病粒率和發(fā)病等級(jí)，并根據(jù)病害等級(jí)計(jì)算出病情指數(shù)(袁婷露等，2008)。供試水稻品種為“秀水09”和“中浙優(yōu)1號(hào)”。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：將病害等級(jí)分成9級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)見表2．2。表2．2水稻穗腐病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table2-2Severityratingstandardforricespikeletrotdisease(RSRD)2．10病原鐮刀菌產(chǎn)毒研究探索2．10．1粗毒素制備毒素原液制備：將菌菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)接入Richard培養(yǎng)基，搖床(25。C，120r／min)培養(yǎng)15d，濾去菌絲，濾液高溫高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，2014 廣西大掌碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒。繁研究min)備用(陸鳴等，1992：田雪亮等，2006；李俊霞等，2011)。粗毒素制備：采用活性炭吸附法，200mL毒素原液中加入活性炭50g，4℃處理24h，濾掉溶液，加100mL甲醇浸泡活性炭(3次重復(fù))，除去不容物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65℃、20ffmin減壓濃縮甲醇溶液至褐色即為粗毒素，4℃保存?zhèn)溆?陸鳴等，1992：袁樹忠等，2011)。2．10．2最佳產(chǎn)毒條件本次試驗(yàn)采用毒素原液對水稻種子胚根的生長抑制率來代表粗毒素濃度大小(陸鳴等，1992；田雪亮等，2006；李俊霞等，2011)。將上述毒素原液分別取lOmL加入鋪兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放入10粒催芽至露白的水稻種子，用無菌水作為對照處理，25℃保濕培養(yǎng)5天，測量種子根長，每個(gè)處理3次重復(fù)，供試水稻品種為“秀水09”。根抑制率(％)=(對照種子平均根長．處理種子平均根長)÷對照種子平均根長x1002．10．2．1培養(yǎng)基將每種病原菌菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)在無菌條件下分別接入裝有200mLPDB、PSB、Richard、Czapek培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床25℃、120r／min培養(yǎng)15d，濾去菌絲體，濾液高溫高壓滅菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后4℃保存?zhèn)溆?陸鳴等，1992；李俊霞等，2011)。2．10．2．2溫度將每種病原菌菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)在無菌條件下接入裝有200mLRichard培養(yǎng)基的三角瓶中，將搖床溫度設(shè)定成10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃6個(gè)不同處理，120r／min培養(yǎng)15d，濾去菌絲體，濾液高溫高壓滅菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后4℃保存?zhèn)溆?陸鳴等，1992；李俊霞等，2011)。2．10．2．3pH將滅菌后的Richard培養(yǎng)基pH分別調(diào)至4、5、6、7、8、9、10，分裝至滅菌的三角瓶中，每瓶200mL，無菌條件下接入各種病原菌菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)，搖床25℃、120r／min培養(yǎng)15d，濾去菌絲體，濾液高溫高壓滅菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后4℃保存?zhèn)溆?陸嗚等，1992：李俊霞等，2011)。2．1O．2．4培養(yǎng)時(shí)間將每種病原菌菌餅(獲得菌餅方法同2．6．3．2)在無菌條件下分別接入裝有200mLRichard培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床25℃、120dmin培養(yǎng)，分別培養(yǎng)5d、10d、15d、15 水稻穗盾}病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究20d、25d、30d后，濾去菌絲體，濾液高溫高壓滅菌(121℃，2．4x105Pa，20min)，4。C保存?zhèn)溆?劉艷等，2009)。2．10．3粗毒素的毒性分析2．10．3．1對種子發(fā)芽率的影響按各種病原鐮刀菌的最佳產(chǎn)毒條件制備粗毒素原液。按照2．10．2的方法計(jì)算根抑制率和芽抑制率。芽抑制率(％)=(對照種子平均芽長．處理種子平均芽長)÷對照種子平均芽長×1002．10．3．2對幼苗的毒害作用育秧盤中培育“秀水09”秧苗，待幼苗長至2葉l心時(shí)，將幼苗取出，無菌水將幼苗根洗凈，放入試管(5×100mm)中，加入10mL的營養(yǎng)液(范锃嵐，2012)，各取0．1mL的粗毒素加入試管中，以加0．1mL無菌水為對照，每個(gè)處理3次重復(fù)，25℃、光照培養(yǎng)，5d后觀察記錄幼苗發(fā)病情況(田雪亮等，2006)(發(fā)病等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表2．3)。表2．3毒素對幼苗毒害的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(田雪亮等，2006)Table2-3Severityratingstandardofeffectsofcrudetoxinonriceseedling病級(jí)Rates幼苗癥狀Symptomsofriceseedling幼苗葉片無萎蔫；根尖正常幼苗1葉萎蔫，1葉葉尖黃化：根尖正常幼苗1葉萎蔫，l葉整葉黃化：根尖正常幼苗l葉黃化萎蔫，l葉黃化枯死：根尖出現(xiàn)褐點(diǎn)幼苗基本枯死；根尖褐變壞死2．10．3．3對稻穗的毒害作用保鮮盒中(9×16x16cm)中平鋪2層濾紙，噴霧無菌水濕潤濾紙。取剛剛抽穗的水稻稻穗，采取穎殼注射法接種稀釋100倍的粗毒素溶液2mL，以注射無菌水2mL為對照，每個(gè)處理3次重復(fù)。將接種后的稻穗放入保鮮盒中，蓋上蓋子，25℃、光照、保濕培養(yǎng)，觀察記錄稻穗生長狀況。2．10．4粗毒素伏馬菌素檢測按各種病原鐮刀菌的最佳產(chǎn)毒條件制備粗毒素。分別將每份粗毒素稀釋100、1000、10000倍，共得15份毒素樣品。用伏馬菌素高靈敏檢測試劑盒RIDASCREEN⑩16 廣西大掌碩士掌位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究fumonisin(R3401)通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定以上15份毒素樣品中伏馬菌素的含量，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。ELISA檢測方法步驟：(1)加50此標(biāo)準(zhǔn)樣品(試劑盒自備)和待測毒素樣品于96孔板微孔中；(2)每孔加50此的標(biāo)記物；(3)每孔加50gL的抗體；(4)將微孔板放置于恒溫混勻儀上，室溫(20．25℃)、黑暗孵育30min；(5)用微孔洗板機(jī)洗板2．3次，洗掉未連接的酶標(biāo)記物；(6)每孔加100gL發(fā)色試劑；(7)將微孔板放置于恒溫混勻儀上，室溫(20．25℃)、黑暗孵育15rain；(8)每孔加100uL的反應(yīng)停止液，充分混勻，10min后，用酶標(biāo)儀在450nm處，測各微孔吸光值；(9)計(jì)算百分吸光度值(百分吸光度值(％)=各樣品吸光度值÷0標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光度值X100)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各粗毒素樣品中伏馬菌素的含量(吳杰等，2009)。2．11水稻穗腐病大田防治2．11．1供試藥劑①20％異噻菌胺懸浮劑(拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司)。②80％乙膦鋁水分散粒劑(拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司)。③25％肟菌酯+50％戊唑醇水分散粒劑(75％拿敵穩(wěn)水分散粒劑，拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司)。④3％多抗霉素可濕性粉劑(興農(nóng)藥業(yè)(中國)有限公司)。⑤25％咪鮮胺乳油(浙江瑞豐園生物科技有限公司)。⑥15％三唑酮乳油(江蘇建農(nóng)農(nóng)藥化工有限公司)。⑦50％多菌靈可濕性粉劑(浙江泰達(dá)作物科技有限公司)。2．11．2試驗(yàn)處理本試驗(yàn)于2012年4一11月份在中國水稻研究所富陽試驗(yàn)基地轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)田進(jìn)行，試驗(yàn)水稻品種為“秀水09”，采用移栽方式，每小區(qū)25m2，常規(guī)肥水管理，試驗(yàn)區(qū)內(nèi)不施用任何其它殺菌劑，每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列(劉恩勇，2011)。藥劑處理與施藥方法見表2．4。2．11．3調(diào)查與統(tǒng)計(jì)方法待水稻生長至黃熟期，按5點(diǎn)取樣法抽樣調(diào)查每個(gè)小區(qū)水稻穗腐病的發(fā)病情況，每點(diǎn)調(diào)查5叢，統(tǒng)計(jì)每穗發(fā)病粒數(shù)和發(fā)病等級(jí)(分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)同2．9)，并計(jì)算病情指數(shù)和防效，經(jīng)過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析(唐啟義等，2010)。 廣西大掌碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究注：1．處理4，6，7，8中，若兩藥在同一時(shí)期施用，則為現(xiàn)混現(xiàn)用。2．藥劑：①，20％異噻菌胺sc．②，80％膦鋁WG．③，25％肟茵酯+50％戊唑醇WG(75％拿敵穩(wěn)WG)．④，3％多抗霉素wP．⑤．25％咪鮮胺EC．⑥，15％三-唑酮EC．⑦，50％多菌靈WP．Note：1．Mixthetwofungicideswhenspraythematthesametimeoftreatments4，6，7，8．2．Fungicides：①，20％lsotianilSC．②，80％Fosetyl．a(chǎn)luminiumWG．③，25％Trifloxystrobin+50％TebuconazoleWG．④，3％PolyoxinwP．⑤，25％ProchlorazEc．⑥，l5％TriadimefonEC．⑦，50％CarbendazimWP18 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究3結(jié)果與分析3．1病原鐮刀菌的分離和純化共采集感病水稻樣品200份(水稻所試驗(yàn)田160份，嘉興試驗(yàn)田40份)，從樣品中分離并純化獲得鐮刀菌菌株216株(水稻所試驗(yàn)田171株，嘉興試驗(yàn)田45株)。將216株鐮刀菌菌株接種水稻稻穗，均可浸染水稻谷粒，引起谷粒病變。從接種發(fā)病谷粒中再分離的菌株與原接種菌株在PDA平板上的菌落形態(tài)完全一致，大、小型分生孢子相當(dāng)，結(jié)果滿足Koch法則，證明所得216株菌株均為水稻穗腐病的病原菌。3．2病原鐮刀菌鑒定3．2．1形態(tài)學(xué)鑒定(1)GZl、GZ2、GZ33株鐮刀菌的菌落圓形，棉絮狀或毛氈狀，菌絲體初期白色，生長旺盛，后期變?yōu)榈仙虻凵?，可擴(kuò)展至整個(gè)培養(yǎng)皿。大型分生孢子呈鐮刀形或紡錘形，3．5個(gè)隔膜，基部有足胞，大小為19．1．48J3“rn×2．3—5．2run(平均32．3pmx3．4“m)；小型分生孢子卵圓形、長橢圓形等，O．2隔膜，5．2．13．2岬×2．3．4．81．tm(平均8．2I．tmx3．2Ltm)。供試菌株與禾谷鐮刀菌禾谷鐮刀菌(Fgraminearum)有性態(tài)為玉蜀黍赤霉菌(Gzeae)(魏景超，1979；陳鴻逵等，1992；Leslieetal，2006)形態(tài)相吻合(圖3-1)。(2)F01、F02、F03等5株鐮刀菌的菌落圓形，突起，棉絮狀或毛氈狀，菌絲白色質(zhì)密，菌落前期白色，后期肉色，略帶有紫色，可擴(kuò)展至整個(gè)培養(yǎng)皿。大型分生孢子鐮刀形，細(xì)長，少許彎曲，基部有足胞，多數(shù)為3-6隔，大小為19．3．51．4岬×3．0．4．0pm(平均40．1pro×3．2岬)：小型分生孢子較少，長卵形、腎形等，無隔膜，大小為5．0—12．0btm×2．1-4．51．tm(平均7．8l上mx3．0“m)。供試菌株與尖孢鐮刀菌(Foxysporum)(陳鴻逵等，1992；Summerelletal，eta1．；2003；肖榮鳳等，2008)形態(tài)相吻合(圖3—2)。(3)FPl、FP2、FP3等137株鐮刀菌的菌落圓形，毛氈：吠，菌絲體白色，后期中央菌絲體轉(zhuǎn)為淡紫色或紫色，邊緣菌絲轉(zhuǎn)為肉色或淡粉色。大型分生孢子數(shù)量少，呈鐮刀形或紡錘形，具3-6個(gè)隔膜，大小為19．6．49．41．tmx3．0—4．7lam(平均34．6lamx3．5I．tm)：小型分生孢子呈橢圓形、卵圓形、梨形等，O．2個(gè)隔膜，大小為5．2—14．0bu'nx2．2．5．11q 廣西大掌碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究gm(平均8．4gmx3．3pm)。供試菌株形態(tài)與層出鐮刀菌(Eproliferatum)(魏景超，1979；陳鴻逵等，1992；Leslieetal，2006)相吻合(圖3．3)。磬震?黲踺}。1螄m：伊【■I1螄m；日。圖3—1菌株GZl形態(tài)和培養(yǎng)性狀Fig3-1MorphologicalandculturalcharacteristicsofisolateGZ1圖3-2菌株F01形態(tài)和培養(yǎng)性狀Fig3-2MorphologicalandculturalcharacteristicsofisolateFO1圖3-3菌株FPl形態(tài)和培養(yǎng)性狀Fig3-3MorphologicalandculturalcharacteristicsofisolateFP120 。西大掌碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀r菌及相關(guān)毒素研究篷圖3—4菌株GFl形態(tài)和培養(yǎng)性狀Fig3-4MorphologicalandculturalcharacteristicsfisolateGF1黻斟吣0／t二‘醞·s伽炯圖3．5菌株GMl形態(tài)和培養(yǎng)性狀Fig3-5MorphologicalandculturalcharacteristicsfisolateGM1(4)GFl、GF2、GF3等50株鐮刀菌的菌落圓形，突起，棉絮狀或毛氈狀，菌魚白色，生長旺盛，后期變?yōu)榈凵蚰逃蜕?，可擴(kuò)展至整個(gè)培養(yǎng)皿。未發(fā)現(xiàn)大型分E孢子；小型分生孢子長橢圓形、卵圓形、梨形等，無隔膜，大小為4．4—11．6pmx2．3．4．6m(平均7．5pmx3．1“m)。供試菌株形態(tài)與藤倉鐮刀菌(Efidikuroi)有性態(tài)為藤倉齊霉菌(6：fujikuroi)(沈亞恒等，2006；Leslieetal，2006：呂國忠等，2010)相吻}(圖3．4)。(5)GMl、GM2、GM3等21株鐮刀菌的菌落圓形，突起，棉絮狀或毛氈狀，卣絲體白色，生長旺盛，后期變?yōu)榈凵蛉馍?，可擴(kuò)展至整個(gè)培養(yǎng)皿。未發(fā)現(xiàn)大型}生孢子：小型分生孢子呈卵圓形、長橢圓形等，0．1隔膜，大?。簽?．6—11．5pmx2．4．4．7。ji。峪醺一繇 廣西大掌碩士掌位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究pm(平均7．7¨m×3．1pm)。供試菌株形態(tài)與擬輪枝鐮刀菌(Fverticillioidess)有性態(tài)為串珠赤霉菌(Gmonoliformis)(Leslieetal，2006；呂國忠等，2010)相吻合(圖3．5)。3．2．2分子鑒定利用TEF序列的通用引物en和e12對216供試株鐮刀菌菌株的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小在700bp左右。測序結(jié)果：GZl、GZ2、GZ33株試菌株的TEF區(qū)段為708bp；F01、F02、F03等5株供試鐮刀菌的TEF區(qū)段為711bp；FPl、FP2、FP3等137株供試鐮刀菌的TEF區(qū)段為710bp；GFl、GF2、GF3等50株供試菌株的TEF區(qū)段為704bp；GMl、GM2、GM3等21株供試菌株的TEF區(qū)段為710bp。圖3—6病原鐮刀菌TEF片段PCR產(chǎn)物電泳圖注：1，菌株GZl．2，菌株GZ2．3，菌株GZ3．4，菌株F01．5，菌株F02．6，菌株F03．7，菌株FPI．8，菌株FP2．9，菌株FP3．10，菌株GFI．11，菌株GF2．12，菌株GF3．13，菌株GMl．14，菌株GM2．15，菌株GM3．M，DNAMarker．Fig3-6ElectrophoreticanalysisofPCRproductsofTEFsequenceofisolatedFusariumstrainsNote：1，IsolateGZl．2，IsolateGZ2．3，IsolateGZ3．4，IsolateF01．5，IsolateF02．6，IsolateF03．7，IsolateFPl．8，IsolateFP2．9，IsolateFP3．10，IsolateGFl．11，IsolateGF2．12，IsolateGF3．13，IsolateGMl．14，IsolateGM2．15，IsolateGM3．M，DNAMarker．22 廣西大掌碩士掌位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究FPlFP3F．proliferatum(JQ639205)F．proliferatum(J,XB68959)FP2GM2GM3G．moniliformis(JN090163)G．moniliformis(JQ639208)GMlF02F03F01F．oxysporum(AB674272)F．oxysporum(JQ∞54491F．a(chǎn)venaceum(HQ020459)F．a(chǎn)venaceum(HQ020467)F．miscanthi(HF674997)F．miscanthi(HF674998)G．fujikumi(JF699611)GF3G，蜘ikuroi(JF270254)GFlGF2G．zeae(HM744693)F．sporotfichioides(HM744663)F．sporotnchioides(HM744687)G乃G．zeae(JF747146)GZlGZ2F．equiseti(GQ848543)F．equiseti(GQ848547)M．a(chǎn)nisopliae(KC520539)圖3．7基于TEF序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹注：“()”中為對應(yīng)菌株的Genbank登記號(hào)，分支點(diǎn)的數(shù)字表示bootstrap支持率。Fig3-7PhylogenetictreebasedonTEFsequencesNote：Thecontentsin“()”representthesequenceaccessionnumberinGenBank．Thenumbersbesideeachbranchpointsrepresentthepercentagessupportedbybootstrap． 廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)-tlt-素研究將供試菌株的TEF序列通過BLAST與Genbank中己登錄的序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GZl、GZ2、GZ3與禾谷鐮刀菌禾谷鐮刀菌(Fgraminearum，登錄號(hào)：JF747146)的同源性達(dá)到99％；F01、F02、F03等與尖孢鐮刀菌(Foxysporum，登錄號(hào)：JQ965449)的同源性達(dá)到99％；FPl、FP2、FP3等與層出鐮刀菌(FProliferatum，登錄號(hào)：JQ639205)的同源性達(dá)到99％；GFl、GF2、GF3等與藤倉鐮刀菌(Ffujikuroi，登錄號(hào)：JF699611)的同源性達(dá)到99％；GMl、GM2、GM3等與擬輪枝鐮刀菌(Fverticillioidess，登錄號(hào)：JQ639208)的同源性達(dá)到99％。通過MEGA4．0系統(tǒng)對供試菌株和Genbank中己登錄菌株的TEF序列進(jìn)行bootstrap聚類分析(圖3．7)。GZl、GZ2、GZ33個(gè)菌株，F(xiàn)01、F02、F033個(gè)菌株，F(xiàn)PI、FP2、FP33個(gè)菌株，GFl、GF2、GF33個(gè)菌株和GMl、GM2、GM33個(gè)菌株bootstrap水平各自相聚于同一群。因此將GZl、GZ2、GZ3鑒定為禾谷鐮刀菌(Fgraminearum)，有性階段為玉蜀黍赤霉菌(Gzeae)；將F01、F02、F03等鑒定為尖孢鐮刀菌(Foxysporum)；將FPI、FP2、FP3等鑒定為層出鐮刀菌(Fproliferatum)；將GFl、GF2、GF3等鑒定為藤倉鐮刀菌(Efujikuroi)，有性階段為藤倉赤霉菌(Gfujikuroi)：將GMl、GM2、GM3等鑒定為擬輪枝鐮刀菌(Everticillioidess)，有性階段為串珠赤霉菌(Gmonilifc}rme)。216株鐮刀菌菌株中，層出鐮刀菌(Fproliferatum)為優(yōu)勢種，有137株，約占63．4％；藤倉鐮刀菌(Ffujikuroi)為次優(yōu)勢種，有50株，約占23．1％；擬輪枝鐮刀菌(Fverticillioidess)、尖孢鐮刀菌(Foxysporum)和禾谷鐮刀菌禾谷鐮刀菌(Egraminearum)為弱勢種，分別有2l株、5株和3株，約占9．7％、2．3％和1．4％。3．3病原鐮刀菌的生物學(xué)特性3．3．1溫度對病原鐮刀菌生長的影響禾谷鐮刀菌(Fgraminearum)在5-40。C的溫度范圍以內(nèi)都可以生長，適宜的生長溫度為15-35。C，最適生長溫度是25。C，大于40。C或小于5"C菌絲停止生長，25。C下培養(yǎng)5d菌落直徑可達(dá)7．26cm(圖3．8)。尖孢鐮刀菌(Foxysporum)在5．40。C的溫度范圍以內(nèi)都可以生長，適宜的生長溫度為20．35。C，最適生長溫度是25。C，大于40。C或小于5℃菌絲停止生長，25。C下培養(yǎng)5d菌落直徑可達(dá)7．61cm(圖3-9)。24 廣西大掌碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)．毒素研究^暑V蹬毪瓣壤5℃10℃15℃20℃25℃30℃35℃40℃溫度(℃)Temperature圖3．8溫度對禾谷鐮刀菌生長的影響注：柱狀圖上小寫字母表示經(jīng)方差分析Duncan’S新復(fù)極差法，在P<0．05水平下的差異顯著性和極顯著差異。Fig．3-8EffectoftemperatureonmyceliumgrowthofEgraminearumNote：columnswithdifferentlowercaselettersshowthedifferentiaatP<0．05byDuncan’SMultiple—RangetestofAnalysisofVariance．95℃10℃15℃20℃25℃30℃35℃40℃溫度(℃)Temperature圖3-9溫度對尖孢鐮刀菌生長的影響注：柱狀圖上小寫字母表示經(jīng)方差分析Duncan’S新復(fù)極差法，在P<0．05水平下的差異顯著性和極顯著差異。Fig．3-9EffectoftemperatureonmyceliumgrowthofEoxysporumNote：columnswithdifferentlowercaselettersshowthedifferentiaatP<0．05byDuncan’sMultiple-RangetestofAnalysisofVariance．9876S4321O8765432lO-口-∞暑一葛爭—5—8^暑v鼯整漆漣 廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究層出鐮刀菌(Fproliferatum)在5-40*C的溫度范圍內(nèi)都可以生長，適宜的生長溫度為20．35*C，最適生長溫度是25*C，大于40。C或小于5。C菌絲停止生長，25'C下培養(yǎng)5d菌落直徑可達(dá)7．77cm(圖3．10)。藤倉鐮刀菌(Ffujikuroi)在5-40。C的溫度范圍內(nèi)都可以生長，適宜的生長溫度為20．35。C，最適生長溫度是25。C，大于40。C或小于5。C菌絲停止生長，25。C下培養(yǎng)5d菌落直徑可達(dá)8．14cm(圖3．11)。擬輪枝鐮刀菌(Fverticillioidess)在5-40。C的溫度范圍內(nèi)都可以生長，適宜的生長溫度為15-35*C，最適生長溫度是25。C，大于40。C或小于5℃菌絲停止生長，25。C下培養(yǎng)5d菌落直徑可達(dá)7．29cm(圖3—12)。^E0《毪漆遴aS℃10℃15℃20℃25℃30℃35℃40℃溫度(℃)Temperature圖3．10溫度對層出鐮刀菌生長的影響注：柱狀圖上小寫字母表示經(jīng)方差分析Duncan’s新復(fù)極差法，在P