長鏈非編碼RNA CASC2在肺腺癌侵襲遷移中的作用研究.pdf

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1、分類號(hào)：R655密級(jí)：公開學(xué)校代碼：11065學(xué)號(hào)：y0115130110專業(yè)博士學(xué)位論文長鏈非編碼RNACASC2在肺腺癌侵襲遷移中的作用研究作者姓名王棟指導(dǎo)教師沈毅（主任醫(yī)師）專業(yè)領(lǐng)域外科學(xué)（胸外）培養(yǎng)單位醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)系答辯日期2018年5月16日長鏈非編碼RNACASC2在肺腺癌侵襲遷移中的作用研究摘要肺癌目前是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其死亡率居所有腫瘤類型的首位，盡管目前隨著臨床技術(shù)的進(jìn)展及相關(guān)靶向藥物的研發(fā)，肺癌的治療發(fā)生了翻天覆地的變化，但肺癌的五年生存率仍舊未得到明顯改善。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌（80%-85%）及小細(xì)胞肺癌（20%左右），其中非小細(xì)胞肺癌中以

2、肺腺癌為主要病理類型。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，非編碼RNA已成為近年來研究的熱點(diǎn)，非編碼RNA是一類具有調(diào)控作用的大部分不編碼蛋白質(zhì)的RNA，經(jīng)研究非編碼RNA在肺癌中亦發(fā)揮著重要作用。而長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度大于200nt的非編碼RNA，在肺癌中長鏈非編碼RNA已有較多研究報(bào)道。長鏈非編碼RNA可作為腳手架分子促使蛋白-蛋白、蛋白-RNA、RNA-DNA相結(jié)合調(diào)控與腫瘤相關(guān)的分子通路或基因表達(dá)，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等過程。長鏈非編碼RNA還可作為分子陷阱、分子向?qū)У日{(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制。已有的研究報(bào)道在肺癌中表達(dá)異?；虬l(fā)揮重要功能的長鏈非編

3、碼RNA包括HOTAIR、MALAT1、H19、CCAT2等。長鏈非編碼RNACASC2是位于第10號(hào)染色體長臂26的長度大約160kb的首次在子宮內(nèi)膜癌中被發(fā)現(xiàn)的lncRNA。目前研究發(fā)現(xiàn)CASC2在腫瘤中主要發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。在結(jié)直腸癌、胃癌、腎細(xì)胞癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均有l(wèi)ncRNACASC2的相關(guān)報(bào)道。在非小細(xì)胞肺癌中l(wèi)ncRNACASC2的表達(dá)下調(diào)與患者的臨床分期及腫瘤大小具有相關(guān)性，且lncRNACASC2能夠抑制肺癌細(xì)胞系的增殖及動(dòng)物體內(nèi)肺癌移植物的腫瘤生長。然而關(guān)于lncRNACASC2在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制研究報(bào)道較少，且在lncRNACASC2對(duì)肺癌細(xì)胞功能中的探索僅

4、局限在對(duì)細(xì)胞增殖及腫瘤生長的影響。探索研究lncRNACASC2對(duì)肺癌細(xì)胞遷移侵襲等與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)過程對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的治療及改善預(yù)后具有重要意義。目的：本研究我們首次探索了lncRNACASC2在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá)改變及其對(duì)于肺癌細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移等過程的影響，并重點(diǎn)研究探索了lncRNACASC2對(duì)肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響及其作用機(jī)制。明確lncRNACASC2在肺腺癌組織及癌旁組織和肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)改變情況，并將其表達(dá)改變與肺腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TNM分期、Ki-67表達(dá)等臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析研究其相關(guān)性，進(jìn)一步探索lncRNACASC2

5、表達(dá)情況與患者的生存時(shí)間之間的關(guān)系。明確lncRNACASC2在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等的影響，探索lncRNACASC2對(duì)肺癌細(xì)胞系上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程的影響。觀察在肺腺癌細(xì)胞中的lncRNACASC2對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程重要調(diào)控相關(guān)分子SOX4表達(dá)的影I響，闡明肺腺癌組織中l(wèi)ncRNACASC2與SOX4的關(guān)系。方法：本研究分三個(gè)部分，肺腺癌臨床樣本及患者信息均收集自2010年3月至2017年3月共收集到63對(duì)肺腺癌組織及距離肺癌組織15cm以上的癌旁組織，均為青島大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)所得。63位患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療等治療性干預(yù)手段。

6、術(shù)中取得的成對(duì)組織均置于凍存管內(nèi)保存于-80℃冰箱。肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、SPCA1、H1975、PC-9及支氣管上皮細(xì)胞系16HBE均購自上海中科院細(xì)胞庫。使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基、37°C、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞生長達(dá)到80-90%融合時(shí)，按照1:3-1:4傳代。第一部分提取RNA及熒光實(shí)時(shí)定量PCR，使用Trizol法提取組織及細(xì)胞內(nèi)總RNA后使用ReverseTraAceqPCRRTKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書方法采用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后使用SYBgreen法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。主要觀察實(shí)時(shí)定量PCR的熔解曲線是否為特異性單峰，擴(kuò)

7、增效率是否一致，Ct值是否在15-30范圍內(nèi)等。最終通過觀察肺腺癌組織與癌旁組織中目的基因與GAPDHCt值的差值（即2^-ΔΔCt法）來計(jì)算lncRNACASC2在肺腺癌組織中的相對(duì)差異。同時(shí)進(jìn)行免疫組化將存放于-80℃肺腺癌組織及癌旁組織解凍后，經(jīng)過甲醛固定、脫水、包埋、切片等流程后，使用枸櫞酸鉀溶液加熱抗原修復(fù)及3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化氫酶及使用山羊血清封閉后，用抗Ki-67抗體一抗4℃過夜孵育。第二天使用鼠兔通用型免疫組