克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因克隆、重組表達及功能分析

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1、克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達與功能分析克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達及功能分析捅要模式識別受體(Patternrecognitionreceptor,PRR)是由胚系基因編碼的一類參與病原識別的蛋白質(zhì)，它們能夠與微生物表面病原相關(guān)的分子模式(Pathogenassociatedmolecularpattern,PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系統(tǒng)。本研究首先在甲殼動物中建立了RNA干擾技術(shù)，并利用新建立RNA干擾技術(shù)結(jié)合基因原核重組、熒光定量PCR等分子生物學技術(shù)對克氏原螯蝦(Pro

2、cambarusclarkii)的兩個模式識別受體基因脂多糖和f3-1，3一葡聚糖結(jié)合蛋白基因以及C一型凝集素基因進行了研究。首先，通過體外轉(zhuǎn)錄合成目標基因的雙鏈RNA，將雙鏈RNA注射克氏原螯蝦或凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)個體，建立了穩(wěn)定RNA干擾技術(shù)，能夠有效沉默目標基因的表達。而且，這種RNA干擾介導的基因沉默效應能夠系統(tǒng)性的發(fā)生，至少持續(xù)96小時，能夠滿足本研究中對模式識別受體基因功能鑒定的要求。隨后，利用RACE(RapidAmplificationofeDNAEnds)技術(shù)從克氏原螯蝦(

3、ProcambarusclarkiOdfl克隆、鑒定了兩個模式識別受體基因：脂多糖和p．1，3．葡聚糖結(jié)合蛋白基因(命名為PcLGBP^)和C一型凝集素基因(命名為P吐EC)。PcLGBP基因eDNA全序列包含一個1107bp的開放閱讀框(Openreadingframe，ORF)，編碼369個氨基酸。在N末端有一個17個氨基酸的信號肽，表明PcLGBP是一個分泌的胞外蛋白。PcLGBP蛋白的氨基酸序列中包含一個糖基水解酶結(jié)構(gòu)域和一個p一1，3．糖苷鍵識別序列(Phe235．Asp253)以及兩個細胞粘附位點(RGD106．

4、108，157．159)和一個N糖基化位點(NRSI66．69)。在其類葡聚糖酶結(jié)構(gòu)域還包含決定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)PcLGBP與甲殼類動物的脂多糖和B．1，3葡聚糖結(jié)合蛋白LGBP(Lipopolysaccharideandp—l，3一glucanbindingprotein,LGBP)或p一1，3葡聚糖結(jié)合蛋白(B．1，3一glucanbindingprotein,BGBP)同源，與一些昆蟲的革蘭氏陰性細菌結(jié)合蛋白(Gram-negativebacteriaprotein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性

5、高于40％。為分析PcLGBP基因的功能，通過半定量RT-PCR方法研究了其在組織中的分布，并用熒光定量PCR技術(shù)分析了其對細菌刺激的響應，結(jié)果表明PcLGBP基因是肝胰腺特異表達的基因，能響應熱致死鰻弧菌刺激而增強表達，說明PcLGBP基因可能參與螯蝦的細菌防御反應。利用酶聯(lián)免疫法對重組PcLGBP蛋白與細菌和真菌表面多糖的結(jié)合活性進行了鑒定，表明重組克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達與功能分析PcLGBP蛋白能與來源于革蘭氏陰性細菌的脂多糖和來源于真菌的13．1。3．葡聚糖結(jié)合，而對來源于革蘭氏陽性細菌的肽聚

6、糖則沒有結(jié)合活性。為進一步了解PeLGBP基因在細菌防御中的作用，利用RNA干擾技術(shù)沉默尸吐∞P基因的表達，并用三種不同的病原菌進行了細菌侵染實驗。PcLGBP基因沉默顯著降低了克氏原螯蝦對革蘭氏陰性細菌的防御能力，而對革蘭氏陽性細菌侵染沒有顯著的影響。PcLEC基因的eDNA全序列包含一個813bp的ORF，編碼271個氨基酸，在N末端有一個17個氨基酸的信號肽，以及一段富含甘基酸的序列，在C末端有一個糖識別結(jié)構(gòu)域(Carboh)rdraterecognitiondomain，CRD)。另外還有四個半胱氨酸殘基，可能參與形

7、成兩對鏈內(nèi)二硫鍵。PeLEC同甲殼動物、昆蟲等物種的C型凝集素都有明顯的序列相似性?？臻g結(jié)構(gòu)預測表明，PeLEC與經(jīng)典的半乳糖結(jié)合C．型凝集素具有相似的空間結(jié)構(gòu)，有七個13折疊，2+a螺旋共九個二級結(jié)構(gòu)元件，有兩對二硫鍵和一個長環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是一個經(jīng)典的短型凝集素。利用實時定量PCR技術(shù)泖吐EC基因的組織表達和細菌刺激后的時序表達變化進行了檢測。在肌肉、心、肝胰腺、鰓、性腺和血細胞等六個組織中均檢測到PcLEC基因的表達，其中在血細胞和肝胰腺中的表達量最高，而在肌肉、鰓和性腺中的表達量相對較低。同時，熱致死的細菌注射能顯著增酗c

8、LEC基因的表達。對重組PcLEC蛋白進行凝菌實驗表明重組PcLEC對大腸桿菌、鰻弧菌和藤黃微球菌都表現(xiàn)出依賴Ca2+的凝集效應，這種凝集效應能夠被半乳糖和N．乙酰半乳糖胺抑制。酶聯(lián)免疫實驗進一步證實了PeLEC對半乳糖和N．乙酰半乳糖胺具有較強的結(jié)合活性。本研究的結(jié)果表明PcLGBP和P