克氏原螯蝦α-淀粉酶基因的克隆與功能分析

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1、摘要克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）又稱小龍蝦，在分類學上隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱，是一種重要的淡水養(yǎng)殖蝦品種。在其整個生命周期中，蛻皮次數(shù)高達十幾次，且只有經(jīng)過蛻皮才能實現(xiàn)性成熟。而蛻皮受到多種因素的調(diào)控，其中消化酶類扮演者重要的角色。本研究克隆了克氏原螯蝦α-淀粉酶基因并分析了蛻皮激素對α-淀粉酶表達水平的影響。本實驗根據(jù)已有部分序列，設計特異性引物克隆出克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF（openreadingframe）cDNA序列。生物信息學分析表明克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF長1545bp,編碼的蛋白質(zhì)含514個氨基酸殘基，其氨基端19個疏水性氨基酸殘基為信號肽。預測的

2、成熟蛋白的理論相對分子量為55.1kDa,等電點為4.95.通過雙酶切法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-amy，轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)，用不同濃度IPTG進行誘導表達。SDS-PAGE電泳和Westernblot的檢測結(jié)果表明克氏原螯蝦α-淀粉酶融合蛋白能夠在原核表達系統(tǒng)中高效表達，但是重組蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在。用Ni-NTA親和層析柱對α-淀粉酶重組蛋白包涵體進行純化并免疫制備多克隆抗體，ELISA檢測其抗體效價為1:60000。透析法復性純化后的重組蛋白，DNS法測定其酶活為1425±28U/mg。提取克氏原螯蝦肝胰腺、心臟、腸道、胃、肌肉、鰓6個不同組織的總蛋白

3、和總RNA,通過免疫印跡法和實時定量PCR法分析克氏原螯蝦α-淀粉酶的組織表達差異。結(jié)果表明Pc-amyRNA在各組織中表達量差異顯著，在肝胰腺中表達量最高，其次是胃，而其他組織中表達量極低。蛻皮激素刺激48h后Pc-amy表達量明顯下降，表明α-淀粉酶能夠應答克氏原螯蝦蛻皮激素誘導信號。關鍵詞：克氏原螯蝦，α-淀粉酶，蛻皮激素，表達IAbstractTheredswapcrayfishProcambarusclarkii,animportantfreshwateraquacultureshrimpspecies,isbelongstoArthropoda,Crustacea,Decapo

4、da.Throughoutitslifecycle,P.clarkiimoltsaboutadozentimesandmaturesafterecdysis.However,ecdysisisregulatedbyvariousfactorsandthedigestiveenzymesplayanimportantroleinthisprocess.Thecloning,expressionandthebiologicalfunctionofα-amylaseinP.clarkiiwereperformedinthisstudy.Oligonucleotideprimersweredesi

5、gnedbyPrimerpremier5.0softwaretoamplifythecDNAfragmentaccordingtopartialknownsequence.BioinformaticanalysisrevealedthattheORFwas1545bpandencodedaproteinof514aminoacidresidueswithasignalpeptide.Thetheoreticalisoelectricpointandmolecularweightofthematurepolypeptideare4.95and55.1kDa,respectively.Phyl

6、ogeneticanalysisshowedthatthePc-Amywashighlyhomologoustoamylasesfromcrustaceans.TheORFwasligatedtopET-28avectorforprokaryoticexpression.TheexpressionplasmidpET-28A-amywastransformedintoE.coliRosetta(DE3)strainfroproteinexpressionbydifferentconcentrationsofIPTG.SDS-PAGEandwesternblotanalysisshowedt

7、hatarecombinantPc-AmyproteinwasexpressedinE.coliandtherecombinantproteinwaspurifiedbynickelaffinitycolumnchromatography.Inordertoobtainpolyclonalantibody,thepurifiedrecombinantproteinwasusedtoimmunizeNewZealandra