克氏原螯蝦α-淀粉酶基因的克隆與功能分析

《克氏原螯蝦α-淀粉酶基因的克隆與功能分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、摘要克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）又稱(chēng)小龍蝦，在分類(lèi)學(xué)上隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱，是一種重要的淡水養(yǎng)殖蝦品種。在其整個(gè)生命周期中，蛻皮次數(shù)高達(dá)十幾次，且只有經(jīng)過(guò)蛻皮才能實(shí)現(xiàn)性成熟。而蛻皮受到多種因素的調(diào)控，其中消化酶類(lèi)扮演者重要的角色。本研究克隆了克氏原螯蝦α-淀粉酶基因并分析了蛻皮激素對(duì)α-淀粉酶表達(dá)水平的影響。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有部分序列，設(shè)計(jì)特異性引物克隆出克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF（openreadingframe）cDNA序列。生物信息學(xué)分析表明克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF長(zhǎng)1545bp,編碼的蛋白質(zhì)含514個(gè)氨基酸殘基，其氨基端19個(gè)疏水性氨基酸殘基為信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的

2、成熟蛋白的理論相對(duì)分子量為55.1kDa,等電點(diǎn)為4.95.通過(guò)雙酶切法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-amy，轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)，用不同濃度IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳和Westernblot的檢測(cè)結(jié)果表明克氏原螯蝦α-淀粉酶融合蛋白能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，但是重組蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在。用Ni-NTA親和層析柱對(duì)α-淀粉酶重組蛋白包涵體進(jìn)行純化并免疫制備多克隆抗體，ELISA檢測(cè)其抗體效價(jià)為1:60000。透析法復(fù)性純化后的重組蛋白，DNS法測(cè)定其酶活為1425±28U/mg。提取克氏原螯蝦肝胰腺、心臟、腸道、胃、肌肉、鰓6個(gè)不同組織的總蛋白

3、和總RNA,通過(guò)免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR法分析克氏原螯蝦α-淀粉酶的組織表達(dá)差異。結(jié)果表明Pc-amyRNA在各組織中表達(dá)量差異顯著，在肝胰腺中表達(dá)量最高，其次是胃，而其他組織中表達(dá)量極低。蛻皮激素刺激48h后Pc-amy表達(dá)量明顯下降，表明α-淀粉酶能夠應(yīng)答克氏原螯蝦蛻皮激素誘導(dǎo)信號(hào)。關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦，α-淀粉酶，蛻皮激素，表達(dá)IAbstractTheredswapcrayfishProcambarusclarkii,animportantfreshwateraquacultureshrimpspecies,isbelongstoArthropoda,Crustacea,Decapo

4、da.Throughoutitslifecycle,P.clarkiimoltsaboutadozentimesandmaturesafterecdysis.However,ecdysisisregulatedbyvariousfactorsandthedigestiveenzymesplayanimportantroleinthisprocess.Thecloning,expressionandthebiologicalfunctionofα-amylaseinP.clarkiiwereperformedinthisstudy.Oligonucleotideprimersweredesi

5、gnedbyPrimerpremier5.0softwaretoamplifythecDNAfragmentaccordingtopartialknownsequence.BioinformaticanalysisrevealedthattheORFwas1545bpandencodedaproteinof514aminoacidresidueswithasignalpeptide.Thetheoreticalisoelectricpointandmolecularweightofthematurepolypeptideare4.95and55.1kDa,respectively.Phyl

6、ogeneticanalysisshowedthatthePc-Amywashighlyhomologoustoamylasesfromcrustaceans.TheORFwasligatedtopET-28avectorforprokaryoticexpression.TheexpressionplasmidpET-28A-amywastransformedintoE.coliRosetta(DE3)strainfroproteinexpressionbydifferentconcentrationsofIPTG.SDS-PAGEandwesternblotanalysisshowedt

7、hatarecombinantPc-AmyproteinwasexpressedinE.coliandtherecombinantproteinwaspurifiedbynickelaffinitycolumnchromatography.Inordertoobtainpolyclonalantibody,thepurifiedrecombinantproteinwasusedtoimmunizeNewZealandra