克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達和功能分析

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1、中國海洋大學博士學位論文克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達及功能分析姓名：董超華申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：楊官品;宋林生20090601克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達與功能分析克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達及功能分析捅要模式識別受體(Patternrecognitionreceptor,PRR)是由胚系基因編碼的一類參與病原識別的蛋白質，它們能夠與微生物表面病原相關的分子模式(Pathogenassociatedmolecularpattern,PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫

2、系統(tǒng)。本研究首先在甲殼動物中建立了RNA干擾技術，并利用新建立RNA干擾技術結合基因原核重組、熒光定量PCR等分子生物學技術對克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的兩個模式識別受體基因脂多糖和f3-1，3一葡聚糖結合蛋白基因以及C一型凝集素基因進行了研究。首先，通過體外轉錄合成目標基因的雙鏈RNA，將雙鏈RNA注射克氏原螯蝦或凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)個體，建立了穩(wěn)定RNA干擾技術，能夠有效沉默目標基因的表達。而且，這種RNA干擾介導的基因沉默效應能夠系統(tǒng)性的發(fā)生，至少持續(xù)96小時，能夠滿足本研究中對模式識別受體基因

3、功能鑒定的要求。隨后，利用RACE(RapidAmplificationofeDNAEnds)技術從克氏原螯蝦(ProcambarusclarkiOdfl克隆、鑒定了兩個模式識別受體基因：脂多糖和p．1，3．葡聚糖結合蛋白基因(命名為PcLGBP^)和C一型凝集素基因(命名為P吐EC)。PcLGBP基因eDNA全序列包含一個1107bp的開放閱讀框(Openreadingframe，ORF)，編碼369個氨基酸。在N末端有一個17個氨基酸的信號肽，表明PcLGBP是一個分泌的胞外蛋白。PcLGBP蛋白的氨基酸序列中包含一個糖基水解酶結構域和一個p一1，3．

4、糖苷鍵識別序列(Phe235．Asp253)以及兩個細胞粘附位點(RGD106．108，157．159)和一個N糖基化位點(NRSI66．69)。在其類葡聚糖酶結構域還包含決定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)PcLGBP與甲殼類動物的脂多糖和B．1，3葡聚糖結合蛋白LGBP(Lipopolysaccharideandp—l，3一glucanbindingprotein,LGBP)或p一1，3葡聚糖結合蛋白(B．1，3一glucanbindingprotein,BGBP)同源，與一些昆蟲的革蘭氏陰性細菌結合蛋白(Gram-negativebacter

5、iaprotein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于40％。為分析PcLGBP基因的功能，通過半定量RT-PCR方法研究了其在組織中的分布，并用熒光定量PCR技術分析了其對細菌刺激的響應，結果表明PcLGBP基因是肝胰腺特異表達的基因，能響應熱致死鰻弧菌刺激而增強表達，說明PcLGBP基因可能參與螯蝦的細菌防御反應。利用酶聯(lián)免疫法對重組PcLGBP蛋白與細菌和真菌表面多糖的結合活性進行了鑒定，表明重組克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達與功能分析PcLGBP蛋白能與來源于革蘭氏陰性細菌的脂多糖和來源于真菌的13．1。3．葡聚糖結合，而對來源于革蘭

6、氏陽性細菌的肽聚糖則沒有結合活性。為進一步了解PeLGBP基因在細菌防御中的作用，利用RNA干擾技術沉默尸吐∞P基因的表達，并用三種不同的病原菌進行了細菌侵染實驗。PcLGBP基因沉默顯著降低了克氏原螯蝦對革蘭氏陰性細菌的防御能力，而對革蘭氏陽性細菌侵染沒有顯著的影響。PcLEC基因的eDNA全序列包含一個813bp的ORF，編碼271個氨基酸，在N末端有一個17個氨基酸的信號肽，以及一段富含甘基酸的序列，在C末端有一個糖識別結構域(Carboh)rdraterecognitiondomain，CRD)。另外還有四個半胱氨酸殘基，可能參與形成兩對鏈內(nèi)二硫鍵

7、。PeLEC同甲殼動物、昆蟲等物種的C型凝集素都有明顯的序列相似性?？臻g結構預測表明，PeLEC與經(jīng)典的半乳糖結合C．型凝集素具有相似的空間結構，有七個13折疊，2+a螺旋共九個二級結構元件，有兩對二硫鍵和一個長環(huán)狀結構，是一個經(jīng)典的短型凝集素。利用實時定量PCR技術泖吐EC基因的組織表達和細菌刺激后的時序表達變化進行了檢測。在肌肉、心、肝胰腺、鰓、性腺和血細胞等六個組織中均檢測到PcLEC基因的表達，其中在血細胞和肝胰腺中的表達量最高，而在肌肉、鰓和性腺中的表達量相對較低。同時，熱致死的細菌注射能顯著增酗cLEC基因的表達。對重組PcLEC蛋白進行凝菌實

8、驗表明重組PcLEC對大腸桿菌、鰻弧菌和藤黃微球菌都表現(xiàn)出依賴Ca