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1、分類(lèi)號(hào)：密級(jí)：論文編號(hào)：學(xué)號(hào)：50121007503重慶理工大學(xué)項(xiàng)士學(xué)位論文Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗的制備及其對(duì)損傷脊髓的免疫治療研究研究生:陳開(kāi)廷指導(dǎo)教師魯秀敏副教授學(xué)位類(lèi)型學(xué)術(shù)學(xué)位學(xué)科專(zhuān)業(yè)微生物與生化藥學(xué)研究方向基因工程藥物培養(yǎng)單位藥學(xué)與生物工程學(xué)院論文完成時(shí)間2015年3月25曰論文答辯曰期2015年5月29曰1CategoryNumber：LevelofSecrecy：SerialNumber：StudentNumber：50121007503Master'sDissertationofChongqingUniversityofTechn
2、ologyConstructionofNogo-GMCSFcompositenucleicacidvaccineanditsimmunetherapyresearchonspinalcordinjuryPostgraduate:ChenKaitingSupervisor:ProfessorLuXiuminDegreeCategory：AcademicDegreeSpecialty:MicrobialandBiochemicalPharmacyResearchDirection:GeneticallyengineereddrugTrainingUnit:S
3、choolofPharmacyandBioengineeringThesisDeadline:March25,2015OralDefenseDate:May30,20152英文縮寫(xiě)標(biāo)注Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗的制備及其對(duì)損傷脊髓的免疫治療研究摘要脊髓損傷（Spinalcordinjury,SCI）后由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)難以恢復(fù)而造成部分或大部分器官功能的缺失，以致出現(xiàn)四肢癱瘓甚至各種器官功能喪失。因此這類(lèi)疾病的治療需要高昂的治療和護(hù)理費(fèi)用，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和精神壓力。成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)損傷后，中樞神經(jīng)纖維難以再生且難以進(jìn)行自我修復(fù)，但是外
4、周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)纖維損傷之后卻能夠自我修復(fù)并恢復(fù)其相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)功能，主要因?yàn)閮煞N神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維所存在的微環(huán)境不同。中樞神經(jīng)微環(huán)境中存在多種髓磷脂相關(guān)抑制因子(Myelinassociatedinhibitors,MAIs)，在脊髓損傷早期他們會(huì)抑制軸突的再生和后期則促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕的形成。因此通過(guò)改善中樞微環(huán)境以達(dá)到干預(yù)抑制信號(hào)傳遞，促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，可能是針對(duì)脊髓損傷行之有效的治療方法之一。作為一種重要的MAIs，Nogo蛋白主要通過(guò)Nogo-66、Amino-Nogo兩個(gè)功能域參與下游多種受體介導(dǎo)的軸突再生抑制效應(yīng)，因此以這兩個(gè)區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)，阻斷抑制信號(hào)傳
5、遞，可能會(huì)有效促進(jìn)神經(jīng)突的再生和保護(hù)神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的完整；核酸疫苗作為一種新的免疫治療策略近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療研究，這種技術(shù)主要由于成本低，應(yīng)用前景廣等多種優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注；人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落因子（Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GMCSF）具有增強(qiáng)免疫應(yīng)答和促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力，是一種重要的佐劑因子。GMCSF還具有神經(jīng)保護(hù)作用，可激活神經(jīng)干、祖細(xì)胞且抑制膠質(zhì)瘢痕的形成。本實(shí)驗(yàn)采用基因工程方法分別克隆Nogo-66、Amino-Nogo和GM-CSF基因片段，構(gòu)建Nogo-G
6、MCSF復(fù)合核酸疫苗。體內(nèi)觀察該免疫治療策略是否能夠有效地產(chǎn)生Nogo蛋白，進(jìn)而利用機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生Nogo抗體，抑制髓磷脂相關(guān)抑制信號(hào)的傳遞。利用行為學(xué)、組織學(xué)等方法體外觀察Nogo-GMCSF核酸疫苗是否有助于中樞軸突再生和動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，為脊髓損傷的免疫治療研究提供實(shí)踐基礎(chǔ)。主要技術(shù)路線(xiàn)：1.載體的構(gòu)建、鑒定及表達(dá)檢測(cè)將PCR擴(kuò)增的GMCSF、Amino-Nogo及Nogo-66三個(gè)目的片段，分別亞克隆至pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA-GMCSF-NogoN-Nogo66，并進(jìn)行PCR、酶切及基因測(cè)序鑒定。脂質(zhì)體法
7、將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢3重慶理工大學(xué)碩士學(xué)位論文（ChineseHamsterOvary,CHO）細(xì)胞后采用免疫熒光和Western-blot法檢測(cè)其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。2.Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗的制備將重組質(zhì)粒pcDNA-GMCSF-NogoN-Nogo66轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α后，大量擴(kuò)增并收集無(wú)內(nèi)毒素的高濃度質(zhì)粒；以脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒，按不同體積比（2:1、1:1、1:2）混勻得到Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗制劑。用遠(yuǎn)交群（SpragueDawley,SD）大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，肌肉注射免疫制備的核酸疫苗，每周免疫一次，
8、持續(xù)免疫6w，每周跟蹤檢測(cè)各組核酸疫苗所產(chǎn)生的抗體滴度，以獲得最佳免疫制劑。3.
