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《多靶向dna疫苗對大鼠脊髓損傷的治療和評估》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文多靶向DNA疫苗對大鼠脊髓損傷的治療和評估姓名：徐鋼申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)生物學(xué)指導(dǎo)教師：羅學(xué)港20050501博士學(xué)位論文中文摘要摘要相對于周圍神經(jīng)損傷后的自發(fā)性修復(fù)，成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNs)損傷后，被截斷的神經(jīng)元軸突很難再生。這種再生障礙產(chǎn)生的重要原因是cNs的髓鞘和形成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞中含有抑制軸突再生的因子。髓鞘中含有很多軸突生長抑制分子，其中包括N090．八髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin．a(chǎn)ssociated酉ycoprotein，MAG)，少突膠質(zhì)細(xì)胞一髓鞘糖蛋白(oligodendrocy把^myelinglycop
2、rotein，OMgp)和tenaScin-R(TN—R)等。研究者發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，應(yīng)用單克隆抗體或移植雜交瘤細(xì)胞阻斷一個抑制分子比如No叩一A能夠促進(jìn)軸突再生。但是，由于其它抑制分子的存在，單純阻斷一個抑制分子的作用最多有限地改善再生。為此，本研究制備了一個包含多個髓鞘抑制分子抑制性結(jié)構(gòu)域的DNA疫苗，并對此疫苗促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)再生的潛能，可能的機(jī)制，以及是否會造成自體免疫的副作用等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。第一章DNA疫苗的構(gòu)建和體外功能評估目的：制各一個由Nogo．A，MAG和TN．R的抑制性結(jié)構(gòu)域組成的DNA疫苗；在體外檢測它能否阻斷軸突生長抑制分子對神經(jīng)生長的
3、抑制作用；以及是否會造成接種動物發(fā)生自體免疫性腦脊髓膜炎。材料和方法：為了特異的中和多個抑制分子，本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了一個重組DNA分子，它包括大鼠MAG的1—5個似免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，人類‘TN．R的表皮生長因子樣(epidermalgrowthfacto卜lil(e，EGF-L)結(jié)構(gòu)域，Nogo_A的氨基端和N090．66。所有這些都已被證明是抑制神經(jīng)再生的功能性片段。這些DNA序列以開放閱讀框的形式克隆入表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1+中，同時還包括利于蛋白質(zhì)分泌的信號序列，在相鄰的兩個結(jié)構(gòu)域中還加入了3個丙氨酸。為檢測其表達(dá)效率，此重組DNA被轉(zhuǎn)染到COS．
4、1細(xì)胞讓其得到瞬時表達(dá)并收集細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行檢測。下～步需要檢測接種了DNA疫苗的動物是否能夠產(chǎn)生特異的能識別MAG，TN—R，和Nogo—A的抗血清。將DNA疫苗和空的母質(zhì)粒(pcDNA3．1+)以每周一次，每次100pg對Lewis大鼠行肌肉注射，持續(xù)8周。收集免疫前血清，對照血清和抗血清，進(jìn)行斑點印跡博士學(xué)位論文中文摘要試驗(dot_blot)a本研究中還對抗血清是否能夠真正的阻斷MAG，№go．A，和TN．R對神經(jīng)細(xì)胞(系)的抑制作用進(jìn)行了測試。應(yīng)用細(xì)胞排斥試驗，在分別用GST，GST-MAG，GST-TN．R，GST_Nogo—N，和GST-Nogo-66
5、包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入NGl08．15細(xì)胞和原代培養(yǎng)的小腦神經(jīng)元然后培養(yǎng)，觀察這些融合蛋白是否對神經(jīng)元有抑制作用，而抗血清能否阻斷融合蛋白對神經(jīng)元的抑制作用。以免疫前血清作為對照。本研究特別考慮的一個問題是接種此DNA疫苗會否誘導(dǎo)動物發(fā)生自體免疫性脫髓鞘疾病，例如自體免疫性腦脊髓膜炎(EAE)，此疾病經(jīng)常發(fā)生于被髓鞘蛋白免疫的試驗動物中。為此對比觀察了DNA疫苗接種大鼠和EAE大鼠的臨床表現(xiàn)，并進(jìn)行神經(jīng)組織的組織化學(xué)，免疫熒光，和電子顯微鏡對比檢查。結(jié)果：①、將制備的DNA疫苗瞬時性轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)能夠檢測到各個插入片段的表達(dá)，而且在細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測到
6、一個分子量大小約為80kDa的蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)能夠同時被抗No疊。一A和抗TN—R的多克隆抗體免疫共沉淀和識別。②、斑點印跡試驗中，由DNA疫苗接種的動物產(chǎn)生的抗血清能夠識別GsT融合蛋白，包括GsT-MAG，GsT_TN—R，GsT_Nogo—N，和GsT-Nogo一66，但不識別GsT。而免疫前血清和對照血清不能夠識別任何一個蛋白。③、細(xì)胞功能試驗顯示，除GsT以外，所有這些GsT融合蛋白，對NGl08—15細(xì)胞和小腦神經(jīng)元都有明顯的排斥或生長抑制作用；加入抗血清能夠阻斷這些抑制分子對細(xì)胞系和神經(jīng)元的排斥作用，但是免．疫前血清卻無效。④、接種DNA疫苗的大鼠沒有
7、任何類似EAE的臨床表現(xiàn)，免疫熒光染色顯示接種的動物脊髓白質(zhì)中沒有非特異性的細(xì)胞浸潤，而且其組織化學(xué)和電鏡檢查也提示沒有發(fā)現(xiàn)接種的動物髓鞘有明顯的破壞，神經(jīng)元的形態(tài)與正常動物神經(jīng)元沒有明顯的區(qū)別。結(jié)論：研究結(jié)果顯示，哺乳動物細(xì)胞能夠表達(dá)此重組DNA(疫苗)，并將其編碼的融合蛋白分泌到細(xì)胞外，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。在體內(nèi)，DNA疫苗能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生能識別多個抑制分子的多靶向抗血清。而且，細(xì)胞功能試驗顯示，能識別多個抑制分子的抗血清能夠中和抑制分子對神經(jīng)細(xì)胞的抑制作用。同時，此DNA疫苗沒有誘導(dǎo)被免疫的kwis大鼠并發(fā)EAE。Ⅱ博士學(xué)位論文中文摘要第二章DNA疫苗對大
