β-乳球蛋白抗原表位譜的解析及關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體的重組表達(dá)與鑒定

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1、分類號(hào)：R446.61學(xué)校代碼：10062密級(jí)：學(xué)號(hào)：2012602121碩士學(xué)位論文MASTER’SDISSERTATION論文題目：β-乳球蛋白抗原表位譜的解析及關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體的重組表達(dá)與鑒定TITLEAnalysisofβ-lactoglobulinepitopesandrecombinantexpressionandidentificationofkeyepitopesconcatemer（國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目81371882）一級(jí)學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)論文作者：侯麗英指導(dǎo)教師：李會(huì)強(qiáng)教授天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二〇一五年五月分類號(hào)：R446

2、.61學(xué)校代碼：10062密級(jí)：學(xué)號(hào)：2012602121學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位?專業(yè)學(xué)位?學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位論文MASTER’SDISSERTATION論文題目：β-乳球蛋白抗原表位譜的解析及關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體的重組表達(dá)與鑒定TITLEAnalysisofβ-lactoglobulinepitopesandrecombinantexpressionandidentificationofkeyepitopesconcatemer（國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目81371882）一級(jí)學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)論文作者：侯麗英指導(dǎo)教師：李會(huì)強(qiáng)教授導(dǎo)師組成員：李迺昶天津

3、醫(yī)科大學(xué)研究生院二〇一五年五月學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送

4、交論文，并編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。保密，在年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密。（請(qǐng)?jiān)谙鄬?duì)應(yīng)的方框內(nèi)打“√”）學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日導(dǎo)師簽名：日期：年月日中文摘要目的：血清特異性IgE是診斷食物過(guò)敏的重要手段，標(biāo)準(zhǔn)化已知抗原是研制體外特異性IgE診斷試劑的重要前提，制備食物致敏組分的抗原表位重組蛋白是解決抗原標(biāo)準(zhǔn)化的重要措施。本研究以牛奶中最重要的過(guò)敏原“β-乳球蛋白”為例，從分析其抗原表位入手，分析重要抗原表位與患者血清sIgE的反應(yīng)頻率，從而篩選出其關(guān)鍵抗原表位并構(gòu)建關(guān)鍵抗原表位重組體，嘗試采用抗原表位重組體替代天然蛋白的可能性。方法：（1）β-乳球蛋白關(guān)鍵抗原表

5、位篩選及其血清異質(zhì)性分析：首先在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查得牛奶β-乳球蛋白的氨基酸序列（162個(gè)氨基酸），用末端重疊的方法合成β-乳球蛋白的多肽，然后用斑點(diǎn)印跡的方法，以20例牛奶過(guò)敏患者血清中的特異性IgE作為一抗，觀察多肽與牛奶過(guò)敏患者的反應(yīng)頻率有無(wú)差異及不同個(gè)體間所識(shí)別的多肽有無(wú)差異。（2）β-乳球蛋白關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)重組體的構(gòu)建及其初步應(yīng)用研究：將反應(yīng)頻率最高的3個(gè)多肽進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，相鄰兩個(gè)多肽之間用一個(gè)甘氨酸做接頭，首先用DNAStar生物信息學(xué)軟件對(duì)3個(gè)表位的6種組合方式進(jìn)行預(yù)測(cè)，選出最佳組合方式；委托上海生工生物有限公司合成關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體的DNA序列，并與pE

6、T-42a（+）質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，用IPTG誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最后利用鎳柱純化出單一組分的關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體重組蛋白，最后采用western-blot、斑點(diǎn)印跡方法和活性氧傳遞均相發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)鑒定重組蛋白的免疫學(xué)活性。結(jié)果：（1）患者血清中sIgE所識(shí)別抗原表位的異質(zhì)性分析：在20例牛奶過(guò)敏患者血清的斑點(diǎn)印跡結(jié)果中有一部分血清所識(shí)別的多肽相同，如1號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、11號(hào)牛奶過(guò)敏患者血清所識(shí)別的表位均為1號(hào)多肽，有一部分牛奶過(guò)敏患者血清所識(shí)別的表位均不完全相同。根據(jù)多肽反應(yīng)頻率的不同，篩選出β-乳球蛋白最I(lǐng)主要表位

7、的氨基酸序列為AA76-95、AA1-20、AA106-125，主要表位的氨基酸序列為AA91-110、AA61-81、AA121-140，次要表位的氨基酸序列為AA46-65、AA31-50、AA151-162。（2）β-乳球蛋白關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體重組蛋白的表達(dá)及鑒定：通過(guò)DNAStar軟件對(duì)理論上6種組合方式進(jìn)行了分析，得到最佳組合方式，成功構(gòu)建了大腸桿菌原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得大小為36kDa左右的融合蛋白，并純化得到單一組分的36kDa大小的重組蛋白，并經(jīng)免疫印跡法、斑點(diǎn)印跡法鑒定其免疫活性，并利用重組蛋白作為檢測(cè)抗