梭子蟹過(guò)敏原分析及原肌球蛋白關(guān)鍵抗原表位重組表達(dá)

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1、分類號(hào)：R446．61密級(jí)：學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位團(tuán)專業(yè)學(xué)位口③學(xué)校代碼：1062學(xué)號(hào)：2010602781學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)天蚌醬科鼻垮TlANJINM￡DICAl-U鞫IVEf毫SI-I廣y碩士學(xué)位論文MASTER’SDISSERTATION論文題目：梭子蟹過(guò)敏原分析及原肌球蛋白關(guān)鍵抗原表位重組表達(dá)TITLE-TheswimmingcraballergensAnalysisandtrOpOmVOSlnKeye01tooerecomt)mantexoresslon^-^工上(市中小企業(yè)創(chuàng)新基金和市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目)一級(jí)

2、學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)論文作者：李嬋指導(dǎo)教師：李會(huì)強(qiáng)教授導(dǎo)師組成員：李遁昶副教授天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二。一三年五月學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個(gè)人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：盞日期：B年蛔‘日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文

3、的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文，并編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。保密口，在——年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密團(tuán)。(請(qǐng)?jiān)谙鄬?duì)應(yīng)的方框內(nèi)打“√”)學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：期：”年捐‘日期：乃年蛔6日天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文目的：中文摘要食物過(guò)敏是當(dāng)今重大的衛(wèi)生學(xué)問(wèn)題，食物過(guò)敏原的鑒定、純化并制備標(biāo)準(zhǔn)化的過(guò)敏原，是食物過(guò)敏性疾病診斷和治療的中心環(huán)節(jié)。本研究的目的是分別從分析過(guò)敏原和分析待檢IgE

4、多態(tài)性兩方面入手，力爭(zhēng)解決當(dāng)前血清特異性IgE檢測(cè)所存在的問(wèn)題。首先，以梭子蟹為研究對(duì)象，過(guò)敏患者血清中的特異性抗體IgE為“探針”，對(duì)梭子蟹中的主要過(guò)敏原組分進(jìn)行分析；其次，以蟹過(guò)敏患者為研究對(duì)象，分析蟹過(guò)敏患者血清特異性IgE所針對(duì)過(guò)敏原的異質(zhì)性。此外，選擇甲殼類動(dòng)物共同的過(guò)敏原．原肌球蛋白中的一段含有3個(gè)抗原表位的多肽，為重組表達(dá)對(duì)象，重組表達(dá)此段多肽，采用原核生物(大腸桿菌)作為表達(dá)系．統(tǒng)，制備原肌球蛋白肽段的多肽片段，為今后進(jìn)行不同過(guò)敏原關(guān)鍵表位的串聯(lián)體表達(dá)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：1．梭子蟹過(guò)敏原組分的分析：通過(guò)

5、去脂、抽提梭子蟹的總蛋白，SDS．PAGE分析蛋白組分，以蟹過(guò)敏患者血清中的特異性lee作為“探針”，經(jīng)western-blot技術(shù)，分析梭子蟹中的主要與特異性IgE結(jié)合的組分。2．蟹過(guò)敏患者特異性IgE所針對(duì)的過(guò)敏原異質(zhì)性分析：選取50例蟹過(guò)敏患者血清，經(jīng)western．blot技術(shù)分析不同的患者血清中的特異性IgE抗體多態(tài)性，即分析蟹過(guò)敏患者血清特異性IgE所針對(duì)的過(guò)敏原個(gè)體間存在的異質(zhì)性。3．原肌球蛋白中TM32a的重組表達(dá)及免疫活性鑒定：選擇原肌球蛋白中的一段含有3個(gè)抗原表位的多肽(簡(jiǎn)稱為刪32a)。合成TM3

6、2a的DNA序列，選擇pET42a為載體，EcoRI和XhoI雙酶切構(gòu)建質(zhì)粒載體，克隆宿主菌Topl0擴(kuò)增重組質(zhì)粒，利用最常見(jiàn)的原核表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21(DE)，以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并利用載體上的所攜帶的His標(biāo)簽蛋白，用鎳離子純化柱純化出單一組分的TM32a蛋白，免疫印跡法鑒定該目的蛋白的免疫活性。天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果：1．梭子蟹過(guò)敏原組分的分析：梭子蟹的總蛋白粗提液中共觀察到9條主要蛋白條帶。在以陽(yáng)性混合血清為探針的印跡中，94kD、74kD、70kD、48kD、43kD、40kD和36kD處均出

7、現(xiàn)了陽(yáng)性反應(yīng)條帶，但蛋白濃度較高的74kD和70kD的蛋白與混合血清反應(yīng)并不是最強(qiáng)的，相反，蛋白含量中等的94kD的蛋白與混合血清反應(yīng)最強(qiáng)。2．蟹過(guò)敏患者血清特異性IgE所針對(duì)的過(guò)敏原的異質(zhì)性分析：以單例蟹患者血清為研究對(duì)象的westem．blot實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)不同的患者血清中的特異性IgE存在明顯的異質(zhì)性，即不同人的反應(yīng)蛋白數(shù)量和種類都有所不同，其中：①1種蛋白為主要過(guò)敏原；②兩種以上蛋白均為主要過(guò)敏原；③沒(méi)有強(qiáng)反應(yīng)的主要過(guò)敏原，而僅有幾種較輕反應(yīng)的過(guò)敏原。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，其中以36kD的蛋白反應(yīng)率最高，可達(dá)80％。3．原肌

8、球蛋白中TM32a的重組表達(dá)及免疫活性鑒定：合成的原肌球蛋白中的TM32a的DNA序列大小為96bp左右，與pET-42a連接構(gòu)建質(zhì)粒載體，大小為6030bp左右，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得大小為34kD左右的重組蛋白TM32a，將重組蛋白經(jīng)鎳離子柱純化柱純化后，獲得單一組分的34kD大小