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1、第42卷分析化學(xué)fFENXIHUAXUE)研究報(bào)告第11期2014年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1604～1610DOI·10．11895／j．issn．0253-3820．140229蝦過(guò)敏原Penal抗原表位的關(guān)鍵氨基酸分析牟慧高美須李淑榮王志東潘家榮趙杰支玉香李樹錦趙鑫(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193)(北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442)(中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)院，杭州31008)(北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，北京100052)摘要建立了一種利用
2、表位抗體篩選蝦過(guò)敏原Penal抗原表位中關(guān)鍵氨基酸的方法。利用生物信息學(xué)軟件MEGA5計(jì)算Penal中表位的氨基酸組成和出現(xiàn)頻率，并采用DNAMAN軟件對(duì)SDAP數(shù)據(jù)庫(kù)中致敏食物原肌球蛋白的氨基酸保守性分析，綜合兩種方法篩選出各表位可能的關(guān)鍵氨基酸，Epitope1：K，E，N；Epitope2：K，L，E；Epitope3：E，R，D，L，Q；Epitope5：K，L，Q。用丙氨酸取代并合成突變多肽。利用表位抗體，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性免疫斑點(diǎn)法及間接ELISA方法檢測(cè)突變多肽的抗體結(jié)合能力，篩選出各表位的關(guān)鍵氨基酸。分別為：Epitopel：谷氨酰
3、胺；Epitope2：亮氨酸和谷氨酸；Epitope3：亮氨酸和天冬氨酸；Epitope5：亮氨酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了此種篩選關(guān)鍵氨基酸的方法的可行性，為Penal致敏機(jī)理的研究及利用基因修飾脫敏提供了一定的理論依據(jù)。關(guān)鍵詞Penal；抗原表位；突變多肽；關(guān)鍵氨基酸1引言蝦蟹和魚類因其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，被廣大民眾所喜愛。但是蝦類隸屬于國(guó)際糧農(nóng)組織(FAO)公布的八大類食物過(guò)敏原中的甲殼類過(guò)敏原J，蝦過(guò)敏問(wèn)題一直以來(lái)廣受關(guān)注。研究表明，蝦中主要過(guò)敏原是Penal，分子量36kDa，是一種原肌球蛋白J。在食物過(guò)敏中，過(guò)敏原中的抗原表位即抗原決定簇
4、起重要作用’4J。2002年，Ayuso等利用交疊肽合成法，用患者的過(guò)敏血清鑒定出Penal中有5個(gè)IgE結(jié)合區(qū)，共8個(gè)線性抗原表位，見表1。表位主要由5～20個(gè)氨基酸組成，其中每個(gè)氨基酸在表位中所起的作用均不同。有些氨基酸殘基在表位中起關(guān)鍵作用，這些特定氨基酸的存在對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象起了關(guān)鍵性的作用，其發(fā)生變化會(huì)引起蛋白質(zhì)的功能降低甚至喪失J，即核心氨基酸或者關(guān)鍵氨基酸殘基。因此，如何定位出過(guò)敏原中的關(guān)鍵氨基酸，并了解它們的作用機(jī)理，對(duì)脫敏具有重要意義。目前，已經(jīng)有很多關(guān)于關(guān)鍵氨基酸的研究。篩選關(guān)鍵氨基酸的方法主要有兩種，一是對(duì)所有過(guò)敏原進(jìn)行序
5、列比對(duì)，找出其中表位區(qū)域所共有的氨基酸或氨基酸組合。Ernoto等。。通過(guò)序列比對(duì)的方法分析了腹足類及雙殼類動(dòng)物之間的交互作用。Liang等對(duì)3種蟹原肌球蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，分析其同源性超過(guò)99．2％。二是將表位區(qū)域的氨基酸進(jìn)行定向突變，通過(guò)檢測(cè)突變后表位區(qū)域的致敏性來(lái)篩選。早在1996年，Ikagawa等就利用氨基酸替代的方法，分析單個(gè)氨基酸取代對(duì)雪松花粉過(guò)敏原Cryi1表位活性的影響。Lehrer等發(fā)現(xiàn)將Penal的特定位置的氨基酸取代，將會(huì)使其抗原決定簇完全喪失免疫原性。何曉陽(yáng)等利用定點(diǎn)突變的方法分析出了對(duì)人體尼古丁代謝酶CYP2A6和
6、CYP2A13的關(guān)鍵氨基酸殘基。Zheng等¨通過(guò)將蝦原肌球蛋白與人和豬的序列對(duì)比，利用變異氨基酸取代的方法，分析出F和s為peptidel0的關(guān)鍵氨基酸。Cheng等¨采用丙氨酸逐個(gè)替代的方法，分析篩選出了真菌主要過(guò)敏原Peneh18的關(guān)鍵氨基酸。為了研究氨基酸組成對(duì)Penal中表位活性的影響，本課題組以Penal中的一個(gè)IgE結(jié)合區(qū)(氨基酸序列為187—202)為研究對(duì)象的前期工作¨基礎(chǔ)上，合成了Penal中其它4個(gè)IgE結(jié)合區(qū)，篩選出可2014~3．10收稿；20l474接受本文系公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(No．201103007)
7、資助E—mail：meixugao@263．net第11期牟慧等：蝦過(guò)敏原Penal抗原表位的關(guān)鍵氨基酸分析能的關(guān)鍵氨基酸，并用丙氨酸取代。采用Fmoc固相合成法分別合成突變表位肽，并采用電噴霧離子化質(zhì)譜法(ESI—MS)及反相高效液相色譜法(RP—HPLC)檢測(cè)合成的多肽的正確性及純度。采用競(jìng)爭(zhēng)免疫斑點(diǎn)法(Dot—blot)及問(wèn)接酶聯(lián)免疫吸附分析法(iELISA)方法分析突變后多肽的抗體結(jié)合能力，鑒定各表位的關(guān)鍵氨基酸，為Penal致敏機(jī)理的研究及利用基因修飾脫敏提供理論依據(jù)。2實(shí)驗(yàn)部分2．1儀器與試劑Aglientl100反向高效液相色
8、譜儀(美國(guó)Aglient公司)；WatersZQ2000電噴霧離子化質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；WD一9405B型水平搖床(北京六一儀器廠)；HH_4數(shù)顯恒溫水浴(江蘇省金壇
