gateway技術(shù)-克隆、表達(dá)新方法

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1、Gateway技術(shù)克隆、表達(dá)新方法Gateway技術(shù)Gateway技術(shù)：一種克隆操作平臺：把目的基因克隆到入門載體（EntryVector）后，就不用依賴限制性內(nèi)切酶，而靠載體上存在的特定重組位點(diǎn)和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到其它的受體載體（DestinationVector，目的載體）上。Gateway技術(shù)特點(diǎn)：通過去除冗長的亞克隆步驟節(jié)省操作時間，同時將目的基因轉(zhuǎn)移到多個表達(dá)系統(tǒng)，在任何選擇的表達(dá)系統(tǒng)如細(xì)菌，酵母，昆蟲，或哺乳動物進(jìn)行基因的分析表達(dá)。Gateway技術(shù)的靈活性：Gateway技術(shù)的原理Gate

2、way的原理也是建立在噬菌體DNA定點(diǎn)整合到細(xì)菌宿主基因組上。在噬菌體和細(xì)菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位點(diǎn)和大腸桿菌基因組的attB位點(diǎn)可以發(fā)生定點(diǎn)重組，lambda噬菌體DNA整合到大腸桿菌的基因組DNA中，兩側(cè)產(chǎn)生兩個新位點(diǎn)：attL和attR。這是一個可逆的過程，如果在一個噬菌體編碼蛋白Xis和IHF、Int的共同介導(dǎo)下這兩個新位點(diǎn)可以再次重組回復(fù)為attB和attP位點(diǎn)，噬菌體從細(xì)菌基因組上裂解下來。這一過程的方向是受控于兩個重要因素：存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。整合后的附著位點(diǎn)為a

3、ttL（BOP’）attR（POB’）整合位點(diǎn)---attBattP切除位點(diǎn)---attLattR整合過程需要Int和IHF共同作用attBxattP→attLxattR完成構(gòu)建Gateway表達(dá)克隆僅需兩步（1）創(chuàng)建入門克隆,通過PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進(jìn)入門載體。（2）混合包含目的基因的入門克隆和合適的目的載體以及GatewayLRClonase酶，構(gòu)建表達(dá)克隆BP和LR反應(yīng)示意圖BP反應(yīng)LR反應(yīng)反應(yīng)特點(diǎn):入門載體的構(gòu)建（1）限制性內(nèi)切酶消化和連接進(jìn)入入門載體（2）PCR克?。ǘㄏ騎OPO克隆至入門載體或與

4、供載體B×P重組）PCR定向TOPO克隆PCR定向TOPO克隆流程一：實驗前的準(zhǔn)備1：認(rèn)真閱讀INVITROGEN公司的GATEWAY-MANUAL2;在實驗操作前，先要確保你的基因使用高保真的Taq酶克隆經(jīng)過驗證，裝入T載體中3:入門載體質(zhì)粒和目標(biāo)表達(dá)載體質(zhì)粒的抽提。質(zhì)粒的濃度要求比較高，150ng/ul.4:引物設(shè)計。根據(jù)入門載體序列的特點(diǎn)，設(shè)計通用引物和含部分接頭的基因特異性引物引物設(shè)計：1通用引物：attB1adapter:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’attB2adapte

5、r:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’2含部分接頭的基因特異性引物：attB1+geneforward:5’-AAAAAGCAGGCTNN-template-specificsequences-3’attB2+genereverse:5’-AGAAAGCTGGGTN-template-specificsequences-3’BP重組裝入入門載體1:添加attB接頭的PCR以攜帶目的基因質(zhì)粒為模板，加含部分接頭的基因特異性引物,進(jìn)行第一輪PCR2:取第一輪的PCR產(chǎn)物做模板，加入通用引物，

6、進(jìn)行第二輪3：PCR產(chǎn)物的純化4：BP重組反應(yīng)BP重組反應(yīng)ComponentsSampleattB-PCRproduct（>10ng）1-7ulpENTRvector(150ng/ul)1ul5XBPClonaseClonaseenzymemix2ulTEBuffer,pH8.0to10ul25℃溫浴1-16h。隨著時間的延長，可有效增加克隆，但時間不宜超過18h,終止反應(yīng)后，最后取1-5ulBP反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽性克隆，進(jìn)行PCR或驗證，然后抽提質(zhì)粒，酶切驗證。LR重組裝入表達(dá)載體根據(jù)自己實驗?zāi)康?，了解自己將要裝

7、入的載體的結(jié)構(gòu)，原核表達(dá)，超表達(dá)，抑制表達(dá)、特異表達(dá)、GUS/GFP表達(dá)等載體，LR重組反應(yīng)ComponentsSampleEntryclone（50-150ng）1-7ulDestinationvector(150ng/ul)1ul5XLRClonaseenzymemix2ulTEBuffer,pH8.0to10ul25℃溫浴1-16h。終止反應(yīng)后，最后取1-5ulBP反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑取陽性克隆，進(jìn)行PCR或驗證，然后抽提質(zhì)粒，酶切驗證。Gateway技術(shù)的評價一旦構(gòu)建好Gateway入門克隆，蛋白表達(dá)和分析的大門就

8、會向您敞開。使用Gateway技術(shù)，您可以進(jìn)入到幾乎是無數(shù)種的表達(dá)系統(tǒng)。因為沒有一個單一的表達(dá)系統(tǒng)適合于每一種蛋白，優(yōu)化基因表達(dá)的最好方法是在多個系統(tǒng)中分析您的蛋白Invitrogen已將Gateway技術(shù)合并到部分最高級的表達(dá)系統(tǒng)中。無論選擇哪個系統(tǒng)――體外，細(xì)菌，酵母，昆蟲，或哺乳動物――都可以獲得