中國(guó)林蛙抗菌肽的改造于淼

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1、中國(guó)林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性篩選學(xué)生：于淼指導(dǎo)老師：王澈副教授前言抗菌肽自1972年發(fā)現(xiàn)以來，一直受到人們的廣泛重視。它在自然界中極其廣泛地存在，從微生物、昆蟲、動(dòng)物、植物中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過1500種抗菌肽?？咕牡淖饔靡彩欠浅５膹V泛，不僅可以抑制、殺滅細(xì)菌，而且具有抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)等作用。另外，由于抗菌肽特殊的作用機(jī)制，其殺滅細(xì)菌時(shí)，不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性。這些使得抗菌肽極有可能在未來成為一種代替抗生素的理想新藥。然而，大多數(shù)天然存在的抗菌肽抗微生物的活性較差，很難達(dá)到藥用的要求。要提高其生物學(xué)

2、活性，對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造尤為重要。抗菌肽的介紹抗菌肽是一種廣泛存在于生物界的抵抗病原微生物入侵的小分子多肽，是生物先天免疫的重要組成部分，具有廣譜抗菌活性和抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及免疫調(diào)節(jié)等生物活性，其區(qū)別于傳統(tǒng)抗生素的獨(dú)特作用機(jī)理，使其不易產(chǎn)生耐藥性，是一類極具潛力的肽類抗生素。抗菌肽的改造對(duì)含有線性a-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽改造對(duì)含有b-折疊的抗菌肽的改造對(duì)含伸展片層結(jié)構(gòu)的抗菌肽的改造對(duì)環(huán)形抗菌肽的改造材料、試劑、儀器實(shí)驗(yàn)材料：中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)皮膚抗菌肽Temporin-1CEa及其

3、類似物（LK1，LK2(5)，LK2(6)，LK3），MCF-7細(xì)胞,人類血紅細(xì)胞,三氟乙醇（TFE），十二烷基磺酸鈉（SDS）；實(shí)驗(yàn)試劑：生理鹽水，蒸餾水，RPMI-1640，小牛血清，胰蛋白酶，MTT，DMSO，0.1%TFA超純水溶液、0.1%TFA乙腈溶液；實(shí)驗(yàn)儀器：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，CO2培養(yǎng)箱，熒光酶標(biāo)儀（Thermo）；Jasco-810型圓二色光譜儀；UV-7504PC型紫外可見分光光度儀（上海欣茂儀器有限公司）；FA2004型分析天平（上海天平儀器廠）；恒溫水浴鍋,超凈工作臺(tái)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)。Te

4、mporin-1CEa類似物的設(shè)計(jì)由于Temporin-1CEa的陽(yáng)離子性較弱，并且對(duì)紅細(xì)胞的毒性作用較強(qiáng)。所以通過賴氨酸（K）替換Temporin-1CEa中的中性氨基酸殘基，以及帶負(fù)電氨基酸殘基以增加陽(yáng)離子性，并且相對(duì)改變疏水值。電荷數(shù)氨基酸序列分子量MW（Da）平均疏水性兩親性Temporin-1CEa+3FVDLKKIANIINSIFGK-NH21905.311811.30.744LK1+4FVDLKKIANIINSIFKK-NH21990.4811.46470.750LK2（5）+5FKDLKKIANIINSI

5、FKK-NH22019.5210.84120.755LK2（6）+6FVKLKKIANIINSIFKK-NH22003.5711.53530.750LK3+7FKKLKKIANIINSIFKK-NH22032.6110.91180.750Temporin-1CEa螺旋輪模LK1螺旋輪模型LK2(5)螺旋輪模型LK2(6)螺旋輪模型LK3螺旋輪模型采用CD光譜測(cè)定幾種改造肽的α螺旋含量將抗菌肽temporin-1CEa及其類似物樣品分別溶于水、50%（v/v）三氟乙醇（TFE）的水溶液、30mMSDS的水溶液，使樣品終濃度

6、達(dá)到0.3mg/mL。以此來測(cè)定幾種改造肽的a螺旋含量。LK1的CD色譜圖LK2(5)的CD色譜圖LK2(6)的CD色譜圖LK3的CD色譜圖通過高效液相色譜測(cè)定保留時(shí)間來表征改造肽的疏水性抗菌肽的疏水性越大越容易透過紅細(xì)胞發(fā)揮作用，因此疏水性越大藥物作用越好。Temoporin-1CEa25.5178LK125.5150LK2（5）20.7635LK2（6）21.3747LK317.9547Temporin-1CEa及其改造肽的保留時(shí)間從大到小順序依次為Temporin-1CEa，LK1，LK2（6），LK2（5），LK

7、3利用MTT方法檢測(cè)并比較Temporin-1CEa及其類似物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率通過軟件計(jì)算，得出四種改造肽的IC50值為：肽IC50（μM）LK121.16LK2（5）44.84LK2（6）14.49LK329.70四種改造肽中電荷為+6的LK2（6）的IC50值最小,并且LK1以及LK2(6)的IC50值均小于模板肽Temporin-1CEa的IC50值。能說明電荷對(duì)于陽(yáng)離子抗菌肽抑制MCF-7的生長(zhǎng)有一定的影響。采用溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并比較Temporin-1CEa及其類似物對(duì)人紅細(xì)胞的溶血率以上結(jié)果表明，四種

8、改造肽的溶血活性均小于模板肽Temporin-1CEaTemporin-1CEa及其改造肽溶血率濃度（μM）Temporin-1CEaLK1LK2(5)LK2(6)LK3257.3049064.6373370.356722.497030.118915060.068585.5118492.037753.653311.4