普魯蘭酶逆向合成麥芽糖基-α-甜環(huán)糊精

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1、FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES普魯蘭酶逆向合成麥芽糖基-環(huán)糊精張永偉，徐學(xué)明，趙建偉，王金鵬，金征宇(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)摘要以麥芽糖和Ot一環(huán)糊精作為底物，利用普魯蘭酶逆向合成作用合成了麥芽糖基一d一環(huán)糊精。用薄層色譜、液一質(zhì)聯(lián)用對產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，并用薄層色譜對其分離。對影響麥芽糖基一一環(huán)糊精合成的反應(yīng)物摩爾比(麥芽糖／a一環(huán)糊精)、底物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、加酶量、pH等因素分別做了單因素實驗，最終確定了反應(yīng)條件：反應(yīng)物摩爾比(麥芽糖／or一

2、環(huán)糊精)為16：1，反應(yīng)時間24h，反應(yīng)溫度為58℃，加酶量400U／gd一環(huán)糊精，pH4．5。關(guān)鍵詞麥芽糖一一環(huán)糊精，麥芽糖，d一環(huán)糊精，普魯蘭酶環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥化妝品、分析化學(xué)等領(lǐng)域被1材料與方法廣泛應(yīng)用。但是，母體環(huán)糊精一般溶解性較小，具有一定毒性，這就大大限制了其應(yīng)用范圍I3。分支環(huán)1．1材料與試劑糊精是環(huán)糊精的衍生物，在環(huán)糊精分子的羥基上連有普魯蘭酶，無錫杰能科公司；普魯蘭、麥芽糖-一單糖或多糖的殘基，這樣可以擴(kuò)大母體環(huán)糊精的親水環(huán)糊精，日本W(wǎng)AKO公司；所有化學(xué)試劑均為分析純性，改善其溶解性。近些年，對天

3、然環(huán)糊精進(jìn)行糖(AR)；薄層層析硅膠(GF254)，青島海洋化工有限基的側(cè)鏈修飾的科研工作在國外得到重視并取得進(jìn)公司。展，但國內(nèi)才剛剛起步。1．2儀器麥芽糖基一o【一環(huán)糊精(Mal—oL—cycyclodextrin)是儀-101A2型干燥箱，上海市實驗儀器總廠；JB．3型環(huán)糊精在其葡萄糖殘基的第6位碳原子的羥基上偶磁力攪拌機(jī)，上海雷磁新徑儀器有限公司；恒溫水浴聯(lián)1個麥芽糖殘基的分支環(huán)糊精。其在水中溶解度鍋，上海市實驗儀器總廠；Waters600高效液相色譜為43g／(100mL)，且無任何毒性與溶血性，如果能儀；紫外

4、檢測器LichrospherNH2(2．1×250mm)，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，將對食品、醫(yī)藥等行業(yè)產(chǎn)生巨大影Waters公司；質(zhì)譜儀WatersPlatformZMD4000，Wa-響。麥芽糖基．．環(huán)糊精的合成與應(yīng)用研究國外有過ters公司。報道-6]，Naomi等人用麥芽糖基-一環(huán)糊精與Caco一21．3方法細(xì)胞建立模型，突出了麥芽糖基一．環(huán)糊精的無毒1．3．1酶活力的測定性E73。Fukaya等人用麥芽糖基一一環(huán)糊精包合一種治酶活力單位定義：特定條件下(pH4．5，50療哮喘的藥物，包合后藥物利用率是原來的數(shù)十℃)，從

5、普魯蘭底物每分鐘釋放相當(dāng)于葡萄糖的1個倍J，但是麥芽糖基一一環(huán)糊精相關(guān)研究在國內(nèi)尚未還原當(dāng)量所需的酶量為1個酶活力單位(u)。測定方法：1mL原酶液用50mmol的乙酸一乙酸見過相關(guān)報道。鈉緩沖液稀釋至1000倍，取0．2mL酶液與0．8mL本課題組采用酶法合成麥芽糖基一-環(huán)糊精，并質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．5％的普魯蘭緩沖液，在50℃下反應(yīng)5對其進(jìn)行了簡單的分離和結(jié)構(gòu)鑒定，同時對影響產(chǎn)物min，以Smogyi—Nelson比色法測還原糖m。產(chǎn)量的各因素進(jìn)行了研究，填補了國內(nèi)麥芽糖基一0【一最終測定的酶活為452U／mL。環(huán)糊精合成

6、研究的空白，為解決技術(shù)壁壘及國內(nèi)進(jìn)行麥芽糖基一．環(huán)糊精合成研究提供數(shù)據(jù)參考。1．3．2麥芽糖基．僅一環(huán)糊精得率計算第一作者：碩士(金征宇教授為通訊作者)。得率／％=蒜慧。國際科技合作項目(2007DFA31120)，江蘇省自然科學(xué)基金創(chuàng)新1．3．3麥芽糖基．．環(huán)糊精合成學(xué)者攀登項目(BK2008003)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室利用麥芽糖和d一環(huán)糊精作為底物，以普魯蘭酶2008年度目標(biāo)導(dǎo)向項目(SKLF—MB一200804)收稿日期：2009—02—05，改回13期：2009—04一O8作為催化劑在一定條件下逆向反

7、應(yīng)合成Mal--CD。1．3．4麥芽糖基．一環(huán)糊精的鑒定46lQ!：曼曼：魚(!!旦!曼曼對1．3．3合成的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行100℃滅酶15l296．3lo0rain，然后稀釋10倍，10000r／min離心30rain，洗脫、濃縮、冷凍干燥得產(chǎn)品。用0．45m微濾膜過濾，采用液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行對凍干產(chǎn)品定性，采用ESI一離子方％1297．8式，離子源溫度為100℃，脫溶劑溫度250℃，質(zhì)量范1295．4l298．7圍200—1500m／z。O605．6。}、f==~1533．92結(jié)果與分析5(x】l0D0l5002．1檢測條件

8、的建立圖2反應(yīng)產(chǎn)物負(fù)離子質(zhì)譜圖經(jīng)過反復(fù)的實驗，確定液質(zhì)聯(lián)用檢測條件為：流動相(乙腈)：(水)=52：48，流速0．3mL／min，柱溫35℃，進(jìn)樣量為15L，標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)產(chǎn)物的液質(zhì)聯(lián)用圖譜如圖1所示。麥芽糖基-．環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)品在0i“_ll—4．24rain處出峰，樣品在4．25rain處出峰，出峰時間基本一致。對4．25rain出峰