《血清學(xué)實驗技術(shù)》PPT課件

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1、第二十四章血清學(xué)試驗第一節(jié)血清學(xué)反應(yīng)概論概念：在體外進行的抗原抗體反應(yīng)，一般采用血清進行，稱為血清學(xué)反應(yīng)Ag血清(Ab)Ag-Ab復(fù)合物pH7.0370C一、血清學(xué)反應(yīng)的一般規(guī)律二、血清抗體的制備原則三、影響血清學(xué)反應(yīng)的因素四、血清學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用一、血清學(xué)反應(yīng)的一般規(guī)律（一）抗原與抗體結(jié)合的膠體形狀變化抗體在溶液中以膠體狀態(tài)存在++++++--------------++++++范德華力抗原抗體互補空間關(guān)系有助于該力發(fā)揮作用。靜電引力氨基與羧基氫鍵結(jié)合力大于范德華力疏水作用抗原抗體分子上非極性氨基酸，提供的作用力最大(二)抗原抗體作用的結(jié)合力比例適合才出現(xiàn)最強的反

2、應(yīng)。沉淀反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的等價帶:最適比時，抗原抗體結(jié)合充分，沉淀物形成快而多，上清中存在少量游離。帶現(xiàn)象：如抗原或抗體過剩，其結(jié)合價不能相互飽和，則抗原與抗體僅能形成小分子的復(fù)合物，不出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)。（三）抗原抗體的結(jié)合比例前帶后帶非共價鍵結(jié)合，一定條件下可解離結(jié)合強度取決于特異性抗體Fab片段與抗原決定簇立體構(gòu)型的吻合程度稀釋和凍融可使復(fù)合物解離解離與否：1、親和力；2、環(huán)境因素（pH、離子強度）（四）抗原與抗體結(jié)合的可逆性利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的可逆性規(guī)律，建立親和層析技術(shù)，純化免疫純的抗原或抗體。第一階段：特異性結(jié)合；時間短，數(shù)秒到數(shù)分鐘第二階段

3、：可見反應(yīng)階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀等可見反應(yīng)；時間長，數(shù)分鐘到數(shù)日（五）抗原抗體反應(yīng)的階段性二、血清抗體的制備原則1.免疫動物的選擇選擇動物時應(yīng)考慮以下因素：①抗原來源與動物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠，其免疫源性越強，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。②動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。2.抗原及佐劑(1)免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強弱、動物的個體狀態(tài)、免疫時間、所要求的抗體特性來確定。首

4、次免疫時，劑量不宜過大或過小，以免產(chǎn)生免疫耐受或不能形成足夠刺激。高特異性－低劑量短程免疫；高效價－大劑量長程免疫(2)免疫佐劑:某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。佐劑的種類佐劑一般包括以下幾類：①無機佐劑：如氫氧化鋁、明釩等②生物性佐劑：如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細(xì)胞因子等；③人工合成佐劑：如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（polyA

5、：U）；④油劑：如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；⑤納米佐劑弗氏佐劑（Freund’sadjuvant）,分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種：前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂或吐溫-80）按1：1～1：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動物時，先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成“油包水”乳化液。佐劑與抗原混合乳化的方法：研磨法攪拌混合法佐劑的免疫生物學(xué)作用①增強抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成持久或強的免疫原；②增強機體對抗原刺激的反應(yīng)性，提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度；③改變抗體類型，使產(chǎn)生抗體由IgM型轉(zhuǎn)變?yōu)镮g

6、G型；④引起或增強遲發(fā)性超敏反應(yīng)。佐劑的作用機制佐劑的作用機制歸納起來主要有如下幾種：①可增強抗原的表面積和改變抗原活性基團構(gòu)型，從而增強抗原的免疫原性。②佐劑與抗原混合一起注入機體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲存庫，延長抗原在局部組織的滯留時間，有利于抗原的緩慢釋放。③增強吞噬細(xì)胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細(xì)胞吞噬），促進對抗原的處理，刺激淋巴細(xì)胞增生，從而增強和擴大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。3.免疫途徑與免疫間隔時間免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。免疫間隔時間是影響抗體

7、產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以10～20天為佳，二次后間隔時間一般為7～10天，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不高。4.免疫血清的保存1、4℃保存（6個月）2、低溫保存（-70℃～-20℃，5年）3、真空干燥保存（5～10年）注意點：保存前需經(jīng)除菌保存液含防腐劑避免反復(fù)凍融（分裝）三、影響血清學(xué)反應(yīng)的因素抗體的來源：不同動物的免疫血清反應(yīng)性存在差異。家兔，等價帶寬，抗原過量才出現(xiàn)可溶性免疫復(fù)合物抗體的濃度：相對抗原而言抗體的特異性和親和力：早期抗體特異性較好，親和力低晚期親和力高類型復(fù)雜，反應(yīng)性復(fù)雜單抗的特異性好但親和力低，

8、不適用于低靈敏度的沉淀反