血清學實驗技術 ppt課件.ppt

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1、第二十四章血清學試驗第一節(jié)血清學反應概論概念：在體外進行的抗原抗體反應，一般采用血清進行，稱為血清學反應Ag血清(Ab)Ag-Ab復合物pH7.0370C一、血清學反應的一般規(guī)律二、血清抗體的制備原則三、影響血清學反應的因素四、血清學反應的應用一、血清學反應的一般規(guī)律（一）抗原與抗體結合的膠體形狀變化抗體在溶液中以膠體狀態(tài)存在++++++--------------++++++范德華力抗原抗體互補空間關系有助于該力發(fā)揮作用。靜電引力氨基與羧基氫鍵結合力大于范德華力疏水作用抗原抗體分子上非極性氨基酸，提供的作用力最大(二)

2、抗原抗體作用的結合力比例適合才出現(xiàn)最強的反應。沉淀反應抗原抗體反應的等價帶:最適比時，抗原抗體結合充分，沉淀物形成快而多，上清中存在少量游離。帶現(xiàn)象：如抗原或抗體過剩，其結合價不能相互飽和，則抗原與抗體僅能形成小分子的復合物，不出現(xiàn)肉眼可見的反應。（三）抗原抗體的結合比例前帶后帶非共價鍵結合，一定條件下可解離結合強度取決于特異性抗體Fab片段與抗原決定簇立體構型的吻合程度稀釋和凍融可使復合物解離解離與否：1、親和力；2、環(huán)境因素（pH、離子強度）（四）抗原與抗體結合的可逆性利用抗原抗體特異性結合反應的可逆性規(guī)律，建立親和

3、層析技術，純化免疫純的抗原或抗體。第一階段：特異性結合；時間短，數(shù)秒到數(shù)分鐘第二階段：可見反應階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀等可見反應；時間長，數(shù)分鐘到數(shù)日（五）抗原抗體反應的階段性二、血清抗體的制備原則1.免疫動物的選擇選擇動物時應考慮以下因素：①抗原來源與動物種屬的關系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠，其免疫源性越強，免疫效果越好，而同種系或親緣關系越近，免疫效果越差。②動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大

4、動物。2.抗原及佐劑(1)免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強弱、動物的個體狀態(tài)、免疫時間、所要求的抗體特性來確定。首次免疫時，劑量不宜過大或過小，以免產生免疫耐受或不能形成足夠刺激。高特異性－低劑量短程免疫；高效價－大劑量長程免疫(2)免疫佐劑:某些物質與抗原一起或先于抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答類型，此類物質稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。佐劑的種類佐劑一般包括以下幾類：①無機佐劑：如氫氧化鋁、明釩等②生物性佐劑：如結核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百

5、日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細胞因子等；③人工合成佐劑：如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（polyA：U）；④油劑：如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；⑤納米佐劑弗氏佐劑（Freund’sadjuvant）,分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種：前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂或吐溫-80）按1：1～1：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動物時，先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成“油包水”乳化液。佐劑與抗原混合乳化的方法：研磨法攪

6、拌混合法佐劑的免疫生物學作用①增強抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質變成持久或強的免疫原；②增強機體對抗原刺激的反應性，提高初次應答和再次應答所產生的抗體滴度；③改變抗體類型，使產生抗體由IgM型轉變?yōu)镮gG型；④引起或增強遲發(fā)性超敏反應。佐劑的作用機制佐劑的作用機制歸納起來主要有如下幾種：①可增強抗原的表面積和改變抗原活性基團構型，從而增強抗原的免疫原性。②佐劑與抗原混合一起注入機體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲存庫，延長抗原在局部組織的滯留時間，有利于抗原的緩慢釋放。③增強吞噬細胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原

7、易被吞噬細胞吞噬），促進對抗原的處理，刺激淋巴細胞增生，從而增強和擴大免疫應答的效應。3.免疫途徑與免疫間隔時間免疫途徑通常有皮內、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結免疫法。免疫間隔時間是影響抗體產生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以10～20天為佳，二次后間隔時間一般為7～10天，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不高。4.免疫血清的保存1、4℃保存（6個月）2、低溫保存（-70℃～-20℃，5年）3、真空干燥保存（5～10年）注意點：保

8、存前需經除菌保存液含防腐劑避免反復凍融（分裝）三、影響血清學反應的因素抗體的來源：不同動物的免疫血清反應性存在差異。家兔，等價帶寬，抗原過量才出現(xiàn)可溶性免疫復合物抗體的濃度：相對抗原而言抗體的特異性和親和力：早期抗體特異性較好，親和力低晚期親和力高類型復雜，反應性復雜單抗的特異性好但親和力低，不適用于低靈敏度的沉淀反